基因工程在环境污染治理中的应用ppt课件.ppt
第3讲 基因工程在环境污染治理中的应用,1 基因工程,基因工程是在分子水平上对生物遗传特性进行人为干预，对生物基因进行改造，利用生物生产人们需要的特殊产品 理论上的三大发现 上世纪40年代，发现生物的遗传物质是DNA：Avery肺炎双球菌转化实验 50年代，发现DNA的双螺旋结构 60年代，确立遗传信息的传递方式：操作子学说，密码子破译 技术上的三大发明 工具酶：核酸内切酶，连接酶 载体：质粒 逆转录酶：打破中心法则 1973年，完成了DNA的体外重组并成功转化,分子生物学基础,DNA即脱氧核糖核酸，携带决定生物遗传，细胞分裂、分化、生长以及蛋白质生物合成等生命信息 DNA分子的基本单位是脱氧核糖核苷酸，由碱基、脱氧核糖和磷酸基三部分组成 碱基有四种：A、G、C、T,碱基携带遗传信息，糖和磷酸基起结构作用 DNA分子的骨架由磷酸二酯键连接的多个脱氧核糖组成 一个脱氧核糖核苷酸中五碳糖的3羟基，通过一个磷酸二酯键与邻近五碳糖的5磷酸基相连,DNA的结构,双螺旋结构的要点 两链平行反向且右旋 碱基以氢键互补配对，A=T，GC 螺旋每周含10个碱基对，每周垂直升高340nm，螺旋直径200nm 核主链在螺旋外侧，碱基对平面在内侧且与主链垂直,双螺旋模型可以解释 细胞减数分裂与有性生殖：配子与受精卵的形成 个体发育：受精卵的发育 遗传与变异：碱基序列的保守性、可变性 性状控制：蛋白质的生物合成 双螺旋模型的补充 DNA分子双链可以左旋：Z-DNA DNA分子每圈碱基数具可变性：A-DNA 发现三股DNA 超螺旋结构普遍存在,碱基配对,一条链中的A与另一条链中的T配对，G与C配对，两条链中的碱基序列总是互补的,DNA的复制,从复制起始点开始 半保留复制：两条链均可作为新链合成的模板 半不连续复制：DNA序列的方向性 高度的忠实性：自我校正 多种酶和蛋白因子协同有序作用,DNA的变性、复性与杂交,加热或某些试剂可使DNA碱基间的氢键破坏，双链发生分离，此过程称为变性 变性DNA在一定条件下能恢复双螺旋结构，此过程成为复性,G+C含量高的DNA比较稳定，环状DNA比线状稳定 Tm值：熔点，DNA发生半数变性时的温度 通过测定DNA的Tm值，可以计算其G+C含量 DNA的复性速度跟其分子大小、复杂程度、浓度、离子强度、温度等因素有关,DNA的杂交,复性的DNA分子由不同来源的两个单链DNA分子形成，称为杂交 互补的碱基序列即可发生杂交，一定条件下也可发生少量的偏差（错配、缺失） 利用分子杂交可以求出特定基因的频率、异源DNA的相似程度，研究基因组织、基因定位 分子杂交广泛应用于生物工程、核酸结构分析及功能探讨中，也是研究分子遗传学的重要手段,中心法则,除某些病毒外，大多数生物将其遗传信息储存在DNA分子中，功能的实现必须通过蛋白质 DNA通过自我复制将遗传信息代代相传，并通过RNA将其传给蛋白质 利用DNA为模板合成RNA的过程叫转录 利用RNA为模板合成蛋白质的过程叫翻译,逆转录,以RNA为模板在逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）催化下合成DNA的过程成为逆转录 逆转录和逆转录酶的发现，实现了以真核mRNA为模板，通过逆转录而获得为特定蛋白质编码的基因 利用逆转录酶所建立的cDNA文库为基因的分离和重组提供了重要手段,基因工程概要,基因工程又称DNA重组技术，是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，其实施的四个必要条件是：工具酶，基因，载体，受体细胞 基因工程的特征 外源核酸分子在寄主生物中能够表达 确定的DNA小片段在寄主细胞中能够大量扩增 基因工程包括基因的分离、重组、转移以及基因在受体细胞内的保持、转录、翻译表达等全过程,基因工程的实验步骤,带有目的基因的DNA片段的获取 在体外将带有目的基因的DNA片段连接到载体上，形成重组DNA分子 重组DNA分子导入受体细胞 带有重组体的细胞扩增 重组体的筛选,基因工程工具酶,把DNA分子切割、DNA片段修饰和DNA片段连接等所需的酶成为工具酶 根据其用途可分为三大类 限制性内切酶：识别和切割dsDNA分子内特殊核苷酸顺序的酶，通过水解DNA分子骨架的磷酸二酯键，将完整的DNA分子切开 连接酶：将两段乃至数段DNA片段拼接起来的酶，催化磷酸二酯键的形成 修饰酶：包括DNA聚合酶、逆转录酶、T4多核苷酸酶、碱性磷酸酶等,限制性内切酶的作用,T4DNA酶的连接原理,基因工程载体,能够独立于宿主细胞染色体之外复制的DNA片段即是载体 载体能将外源DNA片段带入受体细胞，并决定外源基因的复制、扩增、传代乃至表达 常见的载体有质粒和病毒 天然质粒和病毒要加以改造，增加耐药性基因片段，以利于提高基因的转化、筛选和表达效率,载体的必备条件,能够进入宿主细胞：个体小，不具备独立生存的能力 在宿主细胞中能够独立复制，即本身是一个复制子：插入外源DNA片段的大小和数量不能破坏载体的复制能力，载体要实现多拷贝 要有筛选标记：抗药性 对多种限制酶有单一或较少的切点 随着DNA重组技术的改进，引入外源DNA进入宿主的方法有改进，已经突破了原有的大小限制；选择标记也可以被杂交技术、免疫学技术等替代,载体的分类,克隆载体：是以繁殖DNA片段为目的的载体，复制力强，拷贝数高 穿梭载体：既能在真核细胞中繁殖又能在原核细胞中繁殖，具有真核和原核两种复制点，常用于真核生物DNA片段在原核生物中的繁殖，然后再转入真核细胞宿主 表达载体：能够在宿主中进行高效表达 理想情况：拷贝数高，具有强启动子和稳定的mRNA，具有高的分离稳定性和结构稳定性，转化频率高，宿主范围广，插入外源基因容量大而且可以重新完整的切除，复制与转录应和宿主相匹配，最好是可调控的，而且在宿主不生长或低生长速率的情况下，仍能高水平的表达目的基因,常用的载体,质粒：环状双链小型DNA分子，可用于细菌细胞，也可用于动植物细胞 噬菌体：常用于细菌细胞 病毒：常用于动物细胞 粘粒：由质粒和噬菌体结合构建成的一种大容量克隆载体,用于原核生物宿主的载体质粒,质粒是能自主复制的双链环状DNA分子，在细菌中独立于染色体存在，其复制和遗传独立，但依赖于宿主所编码的蛋白质和酶,UC 19的结构图谱,BR 322的结构图谱,外源基因克隆如质粒载体的过程,用于原核生物宿主的载体噬菌体,噬菌体内含双链环形、单链环形、双链线形、单链线形等多种形式、大小不一的DNA，且感染率高 噬菌体含有线性双链DNA分子，两端有互补粘性末端，进入宿主细胞后可连接成为环状分子；属温和噬菌体，DNA可整合到宿主细胞染色体DNA上，随染色体复制而复制；可承载较大的外源DNA片段；宿主细胞中有大量供噬菌体包装用的壳蛋白；有多个限制性内切酶的识别序列,噬菌体,用于真核生物宿主的载体人工载体,具有大肠杆菌质粒的抗药性和噬菌体的强感染力，同时能够携带真核生物大片段DNA的目的基因 如柯斯质粒载体（粘质粒载体），既可按质粒载体的性质转化受体菌，并在其中复制，又可以按照噬菌体性质，进行体外包装转导受体细胞,用于真核生物宿主的载体,大多是穿梭质粒，既可在原核细胞中复制扩增，也可以在真核细胞中扩增、表达 酵母质粒：来自酿酒酵母 人工染色体载体：能够承载更大的外源基因 酵母人工染色体：在酵母细胞中克隆外源DNA大片段克隆体系，外源DNA容量为1000kb 细菌人工染色体：以细菌F因子为基础组建的细菌克隆体系，外源DNA容量为300kb,用于植物宿主的载体,由于植物细胞的特殊性，外源基因导入植物细胞的方法十分有限 Ti质粒：能够进入植物细胞并能整合到植物染色体DNA分子中，但其分子太长、限制性酶切位点多，易导致宿主产生不分化的不良植株 植物DNA病毒：宿主范围窄，可插入片段短，易丢失，插入外源DNA后感染力下降，使用很少 植物转座子：在生物体基因组中可从一个基因座位转移到另一个基因座位，有望成为新的植物载体,用于动物宿主的载体,哺乳动物细胞用于外源DNA表达采用的载体很有限，主要是猿猴空泡病毒40（SV40） 含双链环状DNA，只能插入2.5kb的外源基因 感染宿主主要为猴细胞，容易产生有危险的野生型 RNA病毒、痘病毒、人腺病毒、乳头瘤病毒等也可用于动物宿主的病毒载体,原核生物目的基因的获得,基因库的构建：将总DNA酶解获得包含所有基因的DNA片段集，将每一个片段与载体连接并分别导入受体细胞，可得到所有的包含该生物体全套基因的库,基因文库的筛选,通过免疫反应筛选,通过DNA分子杂交筛选,真核生物目的基因的获得,cDNA文库的建立：细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和,基因组DNA文库及cDNA文库组建图,DNA的化学合成：把新的脱氧核糖核苷酸加到DNA双链的5端，与细胞中DNA分子合成的方向相反；目前常用的是磷酰胺法 PCR法：体外通过酶促反应快速扩增特异DNA片段 有与被分离的目的基因两条链各一端序列互补的DNA引物 具有热稳定性的酶 dNTP作为底物 有作为模板的目的DNA序列,目的基因的转移,重组DNA进入受体的过程叫转化，得到重组DNA的细胞叫受体细胞 选择合适的受体细胞：转化效率高、稳定传代、易筛选、外源基因可高效表达和稳定积累；原核生物如大肠杆菌，真核细胞如酵母菌和枯草芽孢杆菌 选择合适的载体：具有强启动子、便于连接、适合受体细胞 选择合适的导入方法：氯化钙导入法、电穿孔法、噬菌体导入法、其他方法,重组体的筛选,传统生物学方法 遗传学方法：抗性筛选插入失活检测，直接筛选；营养缺陷互补筛选蓝白筛选 免疫学方法：有目的蛋白的抗体 利用噬菌斑筛选 核酸杂交法：利用放射性同位素标记的DNA或RNA作探针进行核酸杂交，进行重组体的筛选与鉴定 原位杂交 点杂交 Southern杂交（印迹技术）,利用抗生素抗性基因筛选重组体,原位菌落杂交筛选,Southern杂交原理,DNA序列分析,Maxam-Gilbert化学降解法 用特异的化学试剂修饰DNA分子中的不同碱基，然后用哌啶切断多核苷酸链，通过凝胶电泳分离不同长度的寡核苷酸，对照四组不同反应所产生的电泳带的位置，读出序列 一轮反应只能测定约250bp的序列 Sanger双脱氧法（酶法） 加入双脱氧核苷酸后，DNA链的合成终止，将随机终止的和全合成的DNA链进行电泳分离，可确定碱基的分布 确定A、G、C、T四种碱基的全部序列 光学检测，适用于自动测序,Maxam-Gilbert法测序原理及G反应,双脱氧核苷酸的结构及其终止DNA合成,Sanger双脱氧测序法,2 基因工程在环境污染治理中的应用,合成有机化合物难于生物降解或降解缓慢 基因工程通过改变细胞内的关键酶或酶系统，可以 提高微生物的降解速率 拓宽底物的专一性范围 维持低浓度下的代谢活性 形成降解有毒污染物的新型催化活性 改善微生物的生物学特性,形成降解有毒污染物的新型催化活性,改善微生物的生物学特性,微生物基因改造的主要目标及手段,设计复合代谢途径 代谢工程，利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络，并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及进行遗传修饰，进而完成细胞特性改造 利用对不同底物具有降解活性的酶的组合构建新的复合代谢途径，已应用于卤代芳烃、烷基苯乙酸等的降解 通过引入编码新酶的活性基因，或对现有的基因物质进行改造、重组，构建新的微生物，可用于氯代芳烃混合物的降解 某假单胞菌可利用TNT（2,4,6-三硝基甲苯）为唯一氮源，但不能进一步降解其代谢产物甲苯、氨基甲苯和硝基甲苯；将具有甲苯完整降解途径的质粒导入微生物，并对其进一步修饰消除其硝酸盐还原反应，使得TNT可以完全降解,拓宽氧化酶的专一性 将两种双氧合酶不同组分的编码基因混合，构建复合酶体系，使其实现对联苯和甲苯的同时降解 杂合多组分双氧合酶还可实现对三氯乙烯的降解 综合不同来源的联苯双氧合酶的优势，可以实现对多氯联苯的广谱、高效降解,甲苯-联苯双氧复合酶的复合组成,基因工程微生物的应用增强无机磷的去除,磷是水体富营养化的重要因素，活性污泥法只能去除城市废水中20-40%的无机磷 大肠杆菌中控制磷积累和聚磷酸盐形成的磷酸盐专一输运系统和polyP激酶由pst操纵子编码 通过对polyP激酶编码基因ppk和用于再生ATP的乙酸激酶编码基因ack A进行基因扩增，可以有效提高菌体对无机磷的去除能力,基因工程微生物的应用苯及烷基取代苯的降解,甲苯降解酶具有广泛的底物范围，但无法利用苯 克隆编码甲苯还原酶的基因todC1C2BA，并将重组质粒导入P. putida mt-2中，可以彻底降解苯/甲苯/二甲苯,甲苯的降解途径,基因工程微生物的应用苯酚类污染物的降解,4-壬基苯酚的中间代谢物4-乙酰苯酚会发生积累，在酵母Candida aquaetextoris中引入苯酚羟化酶基因，可实现其完全降解,苯酚的降解途径,基因工程微生物的应用氯代芳香化合物的降解,氯苯的降解过程中，第一步是关键步骤，双加氧酶和脱氢酶是关键酶，增加其编码基因的拷贝数，可加快此步骤,一氯苯的降解途径（最后两步双键有误）,将多氯联苯生物降解过程中假单胞菌的相关降解酶基因导入大肠杆菌中，避免了原始菌修复效率低的缺点，而且不需要联苯诱导 将编码甲苯双加氧酶基因和编码苯甲醇脱氢酶和苯甲醛脱氢酶基因，转座子整合至2-氯苯甲酸降解菌中，可以实现2-氯甲苯的完全矿化,2-氯甲苯的降解途径,基因工程微生物的应用多环芳烃的降解,多环芳烃具有强烈的毒性，不易被微生物降解 根据代谢工程原理，可以通过分析细菌和真菌的代谢网络，确定双加氧酶和单加氧酶所对应的基因，并增加这些基因的拷贝数，强化苯并芘的降解 可以把相关酶的编码基因克隆并重组为一个质粒，导入芳香族化合物降解菌，以提高转化降解速率 改造后的生物细胞可能会出现代谢紊乱、能量不足等问题；质粒在多次传代后可能发生丢失，也可能污染环境菌种,基因工程微生物的应用偶氮染料的降解,偶氮染料降解菌主要通过产生偶氮还原酶对偶氮染料进行脱色，还原为苯胺并进一步降解 将编码偶氮还原酶的特异性基因克隆到大肠杆菌中可以提高其表达量，酶活性也有较大提高,偶氮还原酶降解偶氮染料的可能机理,
