基因工程药物ppt课件.ppt
1,基因工程制药：指利用重组DNA技术，结合发酵工程、细胞工程、酶工程等现代生物技术研制预防和治疗人类、动物重大疾病的蛋白质药物、核酸药物以及生物制品的一门技术。,2,8.1 基因工程药物的发展概况,8.1.1 基因工程药物的发展简史与现状8.1.2 基因工程药物的特点8.1.3 基因工程药物的研发过程,3,8.1.1 基因工程药物的发展简史与现状,1973年，Cohen等，tetr和strr成功重组，基因工程拉开序幕1974年，重组质粒转化大肠杆菌，获得相应抗性1976年，Genentech公司成立1982年，授权Eli Lilly公司基因重组动物疫苗抗眼球病疫苗生产和使用；人胰岛素生产和使用,希克劳,百忧解,4,1984年，凝血因子VIII1985年，注射用促生长素1987年，tPA。,5,主要国家基因工程制药产业化概况,6,基因工程药物现状与前景,2001年，生物技术公司4284家（上市622家），销售总额348亿美元，其中基因药物占70%，250亿美元；美国，1466家，占55%；销售总额285亿美元，占82；上市公司318家，占55%；日本欧洲表8.1,7,我国国情,“起步晚，发展快；项目不多，仿制为主；重复生产，后劲不足”。IL-2，干扰素，粒细胞集落刺激因子（G-CSF），EPO，生长激素。表8.3,8,8.1.2 基因工程药物的特点,1、高技术：人才、技术2、长周期：实验室、中试、临床、规模化生产、市场商品化阶段、监督环节3、高投入4、高风险5、高收益,9,基因工程药物的优点,1、可以得到天然状态难以获得的生理活性物质，改造成新药 胰岛素2、使生理活性物质在各种反应器中获得高表达，符合临床和研究需要3、改造生理活性物质，提高其活性：速效、长效4、可以挖掘和开发更多的新药，获得新物质,10,8.1.3 基因工程药物的研发过程,1、实验室研究阶段（discovery，research）2、基因工程药品的开发阶段（development）3、基因工程药品的临床试验（commercialization）: 、期临床试验4、新药申请和上市,11,8.2 基因工程制药的下游技术,8.2.1 基因工程菌的规模化培养8.2.2基因工程菌细胞膜的破碎8.2.3 基因重组蛋白的分离与纯化,下游技术：表达、分离纯化和活性测定,12,8.2.1 基因工程菌的规模化培养,8.2.1.1 重组大肠杆菌培养基8.2.1.2 基本培养方式8.2.1.3 培养工艺条件对外源基因表达的影响8.2.1.4 培养条件对产物活性、存在形式及释放的影响8.2.1.5 高密度和高表达培养对策,13,8.2.1.1 重组大肠杆菌培养基,C源、N源、无机盐、微量元素、维生素、生物素等LB培养基、M9培养基按组成物质的来源分：合成培养基、天然培养基按存在状态分：固体、液体培养基,14,8.2.1.2 基本培养方式,1、分批培养（batch culture）：在一个封闭培养系统内含有初始限制量的基质的培养方法。培养过程从接种开始，经过4个时期：迟滞期、对数生长期、减速期和稳定期。2、补料分批培养（fed-batch culture ）3、连续培养（continuous culture）4、透析培养（dialysis culture）,15,8.2.1.3 培养工艺条件对外源基因表达的影响,工程菌大规模培养的优化设计和控制对外源基因的高效表达至关重要。工艺：选择合适的发酵系统或生物反应器。生物学方面的因素： 与细菌生长密切相关的条件或因素： 温度、pH值、溶氧、培养基成分 表达条件 诱导物、改变温度 提高外源基因表达产物的总量： 表达水平、菌体浓度,16,8.2.1.4 培养条件对产物活性、存在形式及释放的影响,对产物活性和存在形式的影响：温度和pH值存在形式：包涵体、融合蛋白、分泌型,17,外源基因在大肠杆菌中的表达形式,表达产物可能存在于：细胞质、细胞周质、胞外培养基中表达形式：可溶性蛋白、不溶性蛋白包涵体蛋白融合蛋白分泌型外源蛋白,18,1、包涵体蛋白,包涵体：一定条件下，外源基因的表达产物在大肠杆菌中积累并致密的聚集在一起形成无膜的裸露结构。细胞质中较多，较少细胞周质由蛋白质组成，氨基酸序列正确，空间构象错误，无生物学活性。包涵体优点：易于分离纯化对蛋白酶有较好的抗性,19,2、融合蛋白,融合蛋白：外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因阅读框。受体菌蛋白位于N端，外源蛋白位于C端。融合蛋白优点：稳定性增加：杂合构象，不易被水解具有较高的水溶性和生物学活性能以较高的效率表达：自身蛋白易于分离纯化： 酶水解,20,3、分泌型外源蛋白,分泌型蛋白：指外源基因的表达产物通过运输或分泌的方式穿过细胞的外膜进入培养基中。分泌蛋白需在N端加上信号肽序列。分泌型蛋白优点：简化了纯化工艺使外源蛋白免于被降解有利于形成正确的构象，获得有生物活性的蛋白质。,21,表达蛋白在细胞中的稳定性防止蛋白降解,融合蛋白表达系统：封闭了水解酶作用位点，增加稳定性。分泌蛋白表达系统：分泌到细胞周质、培养基中包涵体表达系统：难溶性的沉淀复合物,不易被宿主蛋白水解酶降解。蛋白水解酶基因缺陷型的受体系统：,22,8.2.1.5 高密度和高表达培养对策,1、高密度培养：2、高表达培养：单因素实验正交实验,23,基因表达产物的分离纯化,收集细胞破碎细胞初步分离柱层析经一步分离纯化,24,8.2.2基因工程菌细胞膜的破碎（一）细胞收集,离心法,贝克曼beckman离心机,25,（二）破碎细胞,变性剂裂解法：哺乳动物 SDS超声波破碎法：细菌和酵母 缓冲液机械破碎法适用于细菌、酵母、植物细胞石英砂、细玻璃珠： 液氮酶解裂解法：细菌、酵母、植物cell,26,8.2.3 基因重组蛋白的分离与纯化8.2.3.1 重组蛋白的分离,1、离心：去除未破碎的细胞和细胞碎片等2、沉淀：盐溶和盐析： (NH4)2SO4 ；有机溶剂沉淀：乙醇、丙酮；等电点沉淀3、膜分离：透析和超滤：透析膜、超滤管,透析,超滤,27,4、双水相萃取：利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异进行萃取的方法。原理：水相中加入溶于水的高分子化合物，形成密度不同的两相体系。形成原因：聚合物的不相容性，即聚合物分子的空间阻碍作用，无法形成均一相。双聚合物：聚乙二醇(PEG)/葡聚糖(Dx)。该系统上相富含PEG，下相富含Dx；,28,5、反胶团萃取：反胶团：是表面活性剂分散在连续的有机溶剂中，自发形成的纳米尺度的一种聚集体。,29,8.2.3.2 基因重组蛋白的纯化方法进一步分离纯化,离子交换层析：等电点的差异 阳、阴离子凝胶柱层析（分子筛）：分子量大小亲和层析：分子间特异相互作用,凝胶层析柱,离子交换柱,亲和层析柱,30,柱层析基本步骤,（1）装柱 （2）柱平衡（3）上样 （4）洗脱（5）样品收集：鉴定脱盐浓缩,自动核酸蛋白分离层析仪,31,基因表达产物的精细纯化,检测、制备和纯化蛋白质 蛋白浓度、纯度测定PAGESDS-PAGEHPLC,32,8.2.3.3 重组蛋白活性的测定,生物活性的保持免疫测定法,33,8.3 几种重要基因工程药物的研发概况,8.3.1 基因工程激素类药物8.3.2 基因工程细胞因子类药物8.3.3 基因工程抗体8.3.4 基因工程疫苗8.3.5 基因工程受体,34,8.3.1 基因工程激素类药物,激素（hormone）：由生物体内分泌腺或特异性细胞产生的微量有机化合物，通过体液或细胞外液运送到特定的作用部位，能引起特殊的生理效应。分类：多肽蛋白类激素、甾醇类激素、脂肪酸类激素如胰岛素、人生长激素、人促卵泡激素,35,激素（hormones）：又称化学信使，是特定细胞合成的，能使生物体发生一定反应的有机分子；它们的作用力很强，很低的浓度就能引起很强的反应；它们都是短命的，在细胞中不能积累，很快就会被破坏。激素都是有特异性的，只对某种或某几种细胞有效，具有接受相应激素的特异受体。,36,激素的传递方式,37,8.3.1.1 胰岛素（ insulin ）,概况：动物胰脏胰岛的细胞以前胰岛素原形式合成跨膜运输后成胰岛素原高尔基体内形成成熟胰岛素。生理功能：治疗糖尿病 降低血糖提高组织摄取葡萄糖的能力抑制肝糖原的分解促进肝糖原和肌糖原的合成,38,胰岛素原的结构,39,基因工程生产人胰岛素的途径,用大肠杆菌发酵生产胰岛素原，在体外将胰岛素原转变为胰岛素。（丹麦NovoNordisk公司）先分别大肠杆菌发酵胰岛素的A链和B链，纯化后再在体外重组产生完整的人胰岛素。（美国Elililly公司）酵母发酵产生前胰岛素原。,40,已上市的基因工程胰岛素药物,1、重组人胰岛素：Humulin、Novoli2、重组人胰岛素类似物：赖脯胰岛素 Humalog，作用快3、甘精胰岛素：Lantus4、门冬胰岛素：Novolog：速效,Humulin,Humalog,41,曾经的II型糖尿病治疗药物,42,研制基因工程药物胰岛素的基本路线?,43,8.3.1.2 生长激素（growth hormone ）,概况：是一类由动物脑垂体前叶分泌的能促进生长的蛋白类激素。191个氨基酸组成，分子量21.5kDa。侏儒症；巨人症；肢端肥大症,44,生长激素生理功能：治疗垂体性侏儒症刺激骨和软骨的生长促进黏多糖及胶原的合成影响蛋白质、糖、脂类的代谢，最终影响肌体的生长与发育,45,第一代：大肠杆菌生产，N端多一甲硫氨酸第二代：分泌蛋白形式，信号肽被自动切去,46,8.3.2 基因工程细胞因子类药物,细胞因子（Cytokine）:由细胞分泌的能调节生物有机体生理功能，参与细胞的增殖、分化和凋亡的小分子多肽类物质。干扰素（IFN）、白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因子（TNF）、生长因子（GF）,47,细胞因子通过与靶细胞表面的特异性受体结合后会引发信号的转导，导致细胞表面结构和功能的变化。作用特点：多相性、网络性、高效性细胞因子生物学功能：调节免疫应答、抗病毒、抗肿瘤、调节肌体造血功能、促进炎症反应。可治疗多种免疫疾病、肿瘤、造血功能障碍等。,48,49,8.3.2.1 干扰素（interferon,IFN）,1957年英国病毒生物学家Alick Isaacs和瑞士研究人员Jean Indenmann首次发现，利用灭活的流感病毒作用于鸡胚绒毛尿囊膜后，可使细胞产生一种干扰病毒繁殖的可溶性物质，称为干扰素。普遍存在：脾脏、肝脏、肾脏、骨髓等；可被多种因素诱发分泌，如病毒，双链RNA等。,50,种类 产生细胞 用途-干扰素 白细胞 I型干扰素 antivirus,anti-tumor-干扰素 成纤维细胞 -干扰素 活化T、NK细胞 型干扰素 immune regulation,干扰素来源、分类与用途,IFN-1b,51,干扰素,位置：位于人第9号染色体上无内含子，5端非编码区+信号肽+编码区+ 3端非编码区组成。表达产物：188-189个氨基酸前体，分泌时切去N端23个氨基酸，165-166个氨基酸的活性产物。四个半胱氨酸（1，29，98/99，138/139），2对二硫键：1 98/99，29138/139。,52,干扰素,位置：位于人第12号染色体上4个外显子+3个内含子表达产物：143个氨基酸有糖基化,53,干扰素生理作用：抗病毒感染：作用于细胞后能合成多种抗病毒蛋白，抑制病毒的复制。调控细胞的生长：可抑制或促进细胞的生长。调节免疫细胞发挥生理效应：在临床上已用于治疗白血病、乙型肝炎、丙型肝炎、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。,54,1976年Greenberg等首先报道用人白细胞干扰素治疗4例慢性活动性乙肝，治疗后有2例HBeAg消失。 1980-1982年，基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素，从每1升细胞培养物中可以得到20-40毫升干扰素。从1987年开始，用基因工程方法生产的干扰素进入了工业化生产，并且大量投放市场。,55,可供临床选用的干扰素,惠福仁（类淋巴母细胞干扰素）：葛兰素威康（英国）重组 IFN-1b，赛若金，国产，深圳科兴 IFN-2a，罗扰素，罗氏公司（瑞士） IFN-2b，干扰能（甘乐能），先灵葆雅（美国）组合干扰素，干复津，安进（美国）。,56,各种亚型的干扰素-（含1或2或2a或2b）疗效近似；因为IFN不能通过胃肠道吸收，临床主要采取肌肉注射和皮下注射2种方式，2h后达到血液最高浓度。吸收率可达80%以上。,57,基因工程生产IFN,大肠杆菌表达体系：温度诱导系统，30振荡培养至AD600达0.4后将温度升高至42 ，继续培养5h。新型干扰素：长效rhIFN-干扰素联合利巴韦林,58,8.3.2.2 红细胞生成素（EPO）,红细胞生成素（EPO）：是一种集落刺激因子。它由肾脏和肝脏产生，其主要功能是刺激造血始细胞分化为红细胞，维持外周血中红细胞的正常水平。7号染色体，5个外显子，成熟165个氨基酸糖基化：只能采用哺乳动物表达系统如CHO细胞。治疗肾功能衰退导致的贫血、非肾性导致的贫血,59,临床用rh EPO,美国Amgen公司的Epogen日本麒麟公司的利血宝（Espo）德国宝灵曼公司的生血素（Recormon）珠海丽珠制药厂等10多家单位：益比奥，宁红欣，爱血宝,60,基因工程生产红细胞生成素的主要步骤？,61,8.3.2.3 白介素（interleukin，IL）,1979年第二届国际淋巴因子研讨会指出，白介素是一类免疫调节因子，指由白细胞产生，介导白细胞或免疫细胞间相互作用的淋巴因子。白细胞介素在传递信息，激活与调节免疫细胞，介导T、B细胞活化、增殖与分化及在炎症反应中起重要作用。,62,白细胞介素（IL）,生理功能：在免疫调节中起重要作用:促进多种T细胞增殖和分化促进天然杀伤细胞的杀伤能力促进B细胞的增殖和分化促进多种细胞因子和细胞因子受体的表达，因而在抗肿瘤和抗感染中发挥重要功能。,63,人白介素-2,又称T细胞生长因子，由133个氨基酸组成的单链，分子量15-17.5kD。3个半胱氨酸（cys58,105, 125），cys58,105之间形成二硫键才有活性。有糖基化位点，但糖基化与否并不影响功能。活性集中在N端。对热不稳定。,人白介素-11,又称脂肪细胞生长抑制因子，由178个氨基酸组成的单链，分子量23-24kD。无半胱氨酸，富含脯氨酸和碱性氨基酸。无糖基化位点。活性集中在C端和Met59。对热稳定，80处理不丧失活性。,64,IL生物活性和临床应用： IL-2：,处于调节机体免疫应答的细胞因子网络的中心环节，对机体免疫监视和抗肿瘤免疫应答具有重要意义。不能直接杀伤肿瘤细胞。用于治疗肿瘤、免疫缺陷和感染性疾病等。用于抗感染治疗，如麻风病。先天和后天性免疫缺陷，如HIV。,65,rhIL-2,1984年批准用于临床试验，1992年FDA批准上市，Proeukin，血管肉瘤，肾癌。国内：1997年先后上市，有安特鲁克，辛洛尔，德路生等。,66,IL-11：,是一种血小板生长因子，用于治疗癌症患者放化疗后血小板减少唯一安全有效药物。 多功能造血细胞因子促进骨髓增殖。银屑病。,67,rhIL-11,1997年美国FDA批准Genetics Institute（GI公司）研制的rhIL-11上市。国内2001年公布批准上市，质量与进口相当，一家为酵母，其余为大肠杆菌表达系统。,68,干细胞因子（hSCF）,又称肥大细胞生长因子，steel因子，kit配体：能刺激骨髓造血干细胞和造血始细胞增殖，是造血干细胞增殖分化的关键因子。与IL-3、EPO等有协同效应。248个氨基酸组成，是一种酸性糖蛋白。,可用于治疗原发或继发性的干细胞功能异常的疾病,69,人表皮生长因子（hEGF）,53个氨基酸组成生理作用：对多种细胞如表皮细胞、上皮细胞等有刺激效应对内皮细胞有刺激作用促进新血管的生成主要用于外伤、溃疡、烧伤等。hEGF还能促进正常表皮细胞的新陈代谢,添加到美容护肤品中可以达到美白、抗皱、延缓衰老的作用。,70,8.3.3 基因工程抗体,抗体（antibody，Ab） ：在抗原物质刺激下产生的，能与相应抗原发生特异性免疫反应的的蛋白质分子。是机体免疫细胞被抗原激活后，由分化成熟的B细胞-浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。,抗体是免疫系统在外界抗原刺激下产生的一种蛋白。,71,抗体结构与功能,组成：2条轻链2条重链抗体作用：体液免疫功能与特异性抗原结合发生免疫反应活化补体与不同受体结合介导型免疫反应或调节吞噬细胞的吞噬功能,72,抗体的产生经历了三个阶段,经典免疫方法产生的异源多克隆抗体细胞工程产生的鼠源单克隆抗体基因工程产生的人源单克隆抗体,单克隆抗体是由识别一种抗原决定簇的细胞所产生的均一性抗体，它反应的特异性高、亲和力强、效价高、血清交叉反应少。,73,抗原制备和提纯与动物免疫,动物免疫 (Balb/小鼠),骨髓瘤细胞及饲养细胞的制备和培养,细胞融合,阳性克隆单克隆化,阳性克隆筛选,有限稀释法,筛选方法建立,单克隆抗体的制备和冻存,单克隆抗体的纯化,单克隆抗体特异性鉴定,单克隆抗体的功能研究,单克隆抗体应用研究,制备单克隆抗体是复杂而费时的工作，整个技术流程。,74,流程,75,基因工程抗体,基因工程抗体：以基因工程技术等高新生物技术为平台，制备的抗体总称。 目前制备的抗体多为鼠源性，临床应用时，对人是异种抗原，重复注射可使人产生抗鼠抗体，从而减弱或失去疗效，并增加了超敏反应的发生。因此，在 80 年代早期，人们开始利用基因工程制备抗体，以降低鼠源抗体的免疫原性及其功能。目前多采用人抗体的部分氨基酸序列代替某些鼠源性抗体的序列，经修饰制备基因工程抗体，称为第三代抗体。,76,基因工程抗体种类,单链抗体：重链和轻链的可变区嵌合抗体：鼠的V区与人的C区,77,制备人源单克隆抗体两种方法,1、将人的整套抗体基因克隆到噬菌体载体上，构建抗体基因库：抗体基因与噬菌体编码外壳蛋白基因相连，抗体与外壳蛋白以融合蛋白的形式进行表达分离带抗体片段的噬菌体颗粒，通过纯化即可获得不同的特异性抗体。2、以人的抗体基因置换小鼠的全套抗体基因：通过抗原物质刺激小鼠，表达出人源特异性抗体。以该方法获得的抗体具有高度的特异性和免疫亲和力。,78,8.3.4 基因工程疫苗,基因工程细菌疫苗： 包括减毒活菌苗、灭活死菌苗、菌苗的蛋白多糖成分等。痢疾、霍乱、伤寒、结核、幽门螺旋杆菌等基因工程病毒疫苗: 牛痘、狂犬病 基因工程亚单位疫苗：指通过基因工程表达具有抗原活性的病毒蛋白质制成的疫苗。 载体疫苗：将抗原基因重组到载体微生物中，使其表达出相应保护性抗原后而制成的疫苗。 基因缺失活疫苗：,
