前列腺特异性抗原(PSA)的检测ppt课件.ppt

前列腺特异性抗原（PSA）的检测,目录,PSA简介,PSA的制备,抗血清的制备,PSA的检测方法,四、,一、,二、,三、,一、 简介,前列腺特异性抗原（Prostate specific antigen，PSA）是由前列腺上皮细胞合成分泌至精液中，是精浆的主要成分之一。 19世纪60年代末，Hare发现，在前列腺液及精液中含有一种分子量大约34000的精液特异性蛋白质前列腺液中以有活性的游离形式（f-PSA）存在，血清中的PSA主要以结合形式存在，通常以f-PSA与结合PSA的和，总PSA（t-PSA）代表血清总的PSA水平。 临床上常用血清PSA密度（PSA与前列腺体积的比值:PSAD）和PSA速率（血清PSA水平的年变化率:PSAV），帮助鉴别良性前列腺增生和前列腺癌,二、的制备,（一）组织和细胞可溶性抗原的粗提,（二）可溶性抗原的提取和纯化,（三）纯化抗原的鉴定,二、的制备,（一）组织和细胞可溶性抗原的粗提,1.组织匀浆的制备 高速捣碎组织法,2.细胞的破碎冻融法,二、的制备,（二）可溶性抗原的提取和纯化-聚乙二醇沉淀法,（三）纯化抗原的鉴定,分子量的鉴定方法- SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,通常选用分子量为2000-6000的PEG，蛋白质分子量越大，沉淀所需PEG浓度越低,三.抗血清的制备,（一）选择免疫动物-雄性成年小鼠（二）免疫方法-皮下注射（三）动物采血法-断尾采血法（四）抗血清的纯化-亲和层析法,四、PSA的检测方法,（一）化学发光法,（二）放射免疫法,（三）电化学发光免疫分析法,（四）Array-ELISA 法,（五）Luminex液相芯片,四、PSA的检测方法,（四）Array-ELISA 法,1.实验原理,Array-ELISA技术平台主要包含3项技术:酶促化学发光技术、现代微阵列技术以及低温电荷耦合器（CCD)成像技术。 原理是在保证相互无干扰的前提下,多种特异性的生物活性物质以特定的微阵列形式排列于每个微孔板板孔内,待血清或血浆中抗体/抗原与包被抗原/抗体特异性结合后,再与酶标抗体结合形成免疫复合物,加入发光液,经生物芯片阅读仪分析处理,可同时获得多项指标定量检测结果,四、PSA的检测方法,仪器与试剂,Roche Cobas601电化学发光分析仪,Array- ELISA原理试剂盒,四、PSA的检测方法,3.方法：-双抗体夹心法,经生物芯片阅读仪分析处理,可同时获得多项指标定量检测结果,四、PSA的检测方法,Luminex液相芯片法,1.实验原理,捕获分子,待测分子,报告分子,四、PSA的检测方法,聚苯乙烯材料，大小均一，直径5.6 um标记了两种荧光染料，每种染料的浓度有10个梯度，通过调整两种染料的比例可以获得100种不同染色的微球标记了针对检测物的捕获分子作为探针,捕获微球,每种微球的地址由两种红色荧光颜料的掺入比例唯一决定,颜色编码的微球,荧光微球,四、PSA的检测方法,红色染料浓度逐渐增大,紫色染色浓度逐渐增大,四、PSA的检测方法,捕获抗体-抗原-检测抗体夹心复合物,四、PSA的检测方法,捕获微球的检测原理,四、PSA的检测方法,样本检测区,检测原理,绿光用于检测荧光信号的强弱,红光用于鉴定微球,四、PSA的检测方法,仪器与试剂,试剂：荧光聚苯乙烯球96孔滤过板ELISA PSA试剂盒抗PSA单克隆抗体5G6(ab10186)和抗PSA单克隆抗体,仪器,Luminex100液相芯片检测仪,ACS180化学发光免疫分析仪,四、PSA的检测方法,3.方法：,微球的交联,藻红蛋白标记二抗,Luminex液相芯片检测,绘制标准品曲线,并建立线性方程,Luminex技术与ELISA方法,高通量检测：用微量标本进行多个指标检测比ELISA的灵敏度高100-10000倍重复性好操作简便、省时省力,四、PSA的检测方法,Thank You!,