分子生物学第四讲 端粒和端粒酶ppt课件.ppt

第四讲 端粒与端粒酶 生命科学与生物制药学院沈晗,线性DNA复制过程中会出现一个问题，复制结束时，随从链的5末端的RNA引物会被细胞中的RNA酶所降解，因为缺乏3-OH，缺口不能被补上，所以每复制一轮，RNA引物降解后新生成的5末端都将缩短一个RNA引物的长度 ，尽管这个引物不长，但是细胞千千万万代地不断复制，如果不进行补偿，染色体不断缩短，最终就会消失 ！1972年，James Watson首先提出了染色体复制的末端隐缩问题,一、端粒概念的提出,1939年，Barbara McClintock（因为发现玉米的转座子获得诺贝尔奖）发现玉米细胞的染色体断裂末端容易融合，而正常染色体的自然末端，为什么不容易相互融合呢？合理的推测是，染色体的自然末端不同于非正常的DNA断裂末端，它应该有一个特殊的结构来避免染色体之间的相互融合。在逐渐明晰了染色体末端特殊结构的概念之后，人们给了它一个专有名称-端粒（telomere）。,二、端粒的基本性质,三、端粒的基本功能,四、端粒的研究历史,2009年10月5日，伊丽莎白布莱克本、卡萝尔格雷德和杰克绍斯塔克三位美国科学家一起获得了今年的诺贝尔生理学或医学奖。关于他们获奖的原因，颁奖词中这样描述：“他们解决了生物学的一个重大问题：在细胞分裂时，染色体如何完整地自我复制以及染色体如何受到保护以免于退化。这三位诺贝尔奖获得者已经向我们展示，解决办法存在于染色体末端端粒，以及形成端粒的酶端粒酶。”这是百年来诺贝尔奖第一次同时颁发给两位女性科学家，他们3人将分享1000万瑞典克朗（约合9667万元人民币）奖金。,三位获奖科学家,3位获奖者中，布莱克本最具名望，2007年曾入选时代百大最具影响力人物。其余两位得主都是自她的研究得到启发，并与她合作取得成果。除了科研了得，她的敢言作风亦为人称道，她曾获美国前总统小布什委任入生物伦理委员会，但她在布什禁止干细胞研究后，公开批评他以意识形态干预科学研究，2004年被辞退。布莱克本出生于澳大利亚，来自一个医生世家，家人期望她从医，但她却决意要走科研之路。1971年，她在英国剑桥大学攻读博士学位，师从诺贝尔得主桑格（Fred Sanger）。1975年获得博士学位后，她转到耶鲁大学，开始研究端粒。1978年在加利福尼亚大学伯克利分校建立实验室，经过不懈努力，终取得重大发现 。,布莱克本发现端粒序列所用到的简单模式生物四膜虫,四膜虫的小染色体众多，也就说端粒可能非常丰富。这就为端粒研究提供了得天独厚的材料。,1978年，布莱克本通过体外合成参入dNTP的实验，利用四膜虫的染色体发现端粒的秘密。推断四膜虫的端粒是由许多重复的5-CCCCAA-3六个碱基序列组成的 。1980年，在一次科学会议上，布莱克本为这个看似无趣的秘密找到了用武之地。这要感谢听她报告的绍斯塔克。当时绍斯塔克正打算给酵母细胞人工合成一条DNA。但是，光秃秃DNA的容易给酵母细胞中的核酸酶吃掉。布莱克本和绍斯塔克一拍即合，决定给DNA片段末端加上这些CCCCAA碱基序列结果让人大吃一惊人工DNA能够稳定的存在于酵母细胞内。1984年，布莱克本的实验室发现酵母的端粒序列是由不太规则的TG1-3/C1-3A重复序列组成的。形象地说，线性DNA就像一条鞋带，端粒就像两头的塑胶套，没有塑胶套的保护，鞋带很容易劈叉，磨损，直至散架,1984年，格雷德作为博士生加盟了布莱克本的实验室。在捣碎无数的四膜虫之后，他们终于成功的分离了端粒酶 。这个端粒酶的名字有点与众不同。我们一般在给酶命名时，都以它的作用对象命名。比如，分解淀粉的叫做淀粉酶，分解蛋白质的叫做蛋白酶。而端粒酶刚好相反，它是以产物命名。更有意思的是，它合成端粒的DNA片断是自带的。也就是说，端粒酶相当于一个小作坊，自己为合成端粒DNA提供复制所需的原材料，完成添加端粒所需的重任。,端粒和端粒酶发现大事记,1939年，Barbara McClintock发现玉米细胞的染色体断裂末端容易融合1972年，James Watson提出染色体复制的末端隐缩问题1978年，报道四膜虫的端粒序列1982年，端粒的发现导致人工染色体的发明1984年，报道酵母的端粒序列1985年，报道四膜虫的端粒酶活性1989年，报道四膜虫端粒酶的RNA亚基1994年，报道酵母端粒酶的RNA亚基1995年，报道酵母端粒酶活性1996年，纯化了四膜虫端粒酶的催化亚基,遗传筛选到酵母端粒酶的催化亚基1997年，证明了四膜虫和酵母端粒酶的催化亚基,端粒和端粒酶的一系列发现完美地解释了这两个问题：染色体末端的DNA由简单重复的端粒序列构成，端粒（保护着染色体末端，使之区别于一般的断裂染色体末端，而不被各种酶降解，相互之间不会融合。端粒酶负责端粒的复制，端粒酶的催化亚基利用端粒酶自己的RNA亚基作为模板通过转位不断重复复制出端粒DNA，从而补偿在染色体复制过程中的末端隐缩，保证染色体的完全复制,五、端粒及端粒酶的结构特点,（一）端粒的结构及组成端粒：是真核细胞线性染色体末端特殊结构。 由端粒DNA和端粒相关蛋白组成。 端粒DNA：为不含功能基因的简单、高度重复序列, 在生物进化过程中具有高度保守性。 不同物种的端粒DNA 序列存在差异。,端粒DNA由两条互相配对的DNA 单链组成, 其双链部分通过与端粒结合蛋白质TRF1和TRF2 结合共同组成t环(t loops)。这种t 环特殊结构可维持染色体末端的稳定,保持染色体及其内部基因的完整性,从而使遗传物质得以完整复制。,电镜下的端粒T环结构,大多数有机体的端粒DNA由非常短而且数目精确的串联重复DNA排列而成，富含鸟嘌呤，人类及其它脊椎动物染色体端粒的结构是5TTAGGG3的重复序列, 长约15kb。体细胞的端粒有限长度大多数明显短于生殖细胞，青年人的TRFs又显著长于年长者，提示TRFs随着细胞分裂或衰老，在不断变短，主要是由于DNA聚合酶不能完成复制成线性DNA末端所致。真核细胞染色体末端会随着细胞分裂而缩短，这个缩短的端粒再传给子细胞后，随细胞的再次分裂进一步缩短。随着每次细胞分裂，染色体末端逐渐缩短，直至细胞衰老。人类体细胞遵循这个规则从细胞出生到衰老，单细胞生物遵循这个规则分裂后定有其它机制保持单细胞生物传代存活，生殖细胞亦如此。,荧光原位杂交显示端粒和端粒DNA序列,（二） 端粒酶的结构 端粒酶在结构上为一核糖核蛋白复合体,由RNA 和结合的蛋白质组成,是RNA依赖的DNA 聚合酶。它是一种特殊的能合成端粒DNA的酶,通过明显的模板依赖方式每次添加一个核苷酸。 端粒酶实质上是一种特殊的逆转录酶 端粒酶RNA(hTR) 端粒酶逆转录酶（TERT） 端粒酶结合蛋白（TEP）,端粒酶示意图,端粒酶活性取决于它的RNA和蛋白质亚基.端粒酶至少包含两个活性位点.端粒酶除了具有反转录活性外，还具有核酸内切酶的活性。另外一个重要的功能就是合成串联重复的TTAGGG序列，为TRF2提供结合位点，防止染色体的末端融合。 端粒酶的RNA亚基是合成端粒DNA的模板，对于端粒酶的结构和催化活性都十分重要.人端粒酶RNA有455个核苷酸.端粒酶RNA重要序列缺乏保守性，但都有保守的二级结构，端粒酶的RNA决定了端粒DNA的序列。,1、端粒酶RNA 哺乳动物端粒酶RNAs在许多组织的不同发育阶段,甚至那些没有端粒酶活性的组织中广泛表达。 体内端粒酶RNA 的存在对端粒酶功能至关重要，影响到端粒酶RNA 的稳定性与突变,也可改变体内端粒长度，并可通过改变端粒完整性或端粒结合因子的末端结合位点致细胞核分裂后期细胞死亡 。,2、端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse transcriptase,TERT) 几乎所有存在端粒酶的机体均含有一单独的TERT 基因, 哺乳动物TERT 的转录由许多转录因子、激素和细胞外信号严格控制。不同的转录因子调节hTERT在不同的细胞内含物中的表达。癌基因c-myc是一个受特殊信号调节的可诱导癌基因, 并可与HRas、NRas、多瘤病毒MT、LT 等癌基因协同作用, 促进细胞无限增殖, 获得永生化并发生癌变。,3、端粒酶相关蛋白(TEP) 端粒酶相关蛋白-1(TEP1)是一多功能的RNA 结合蛋白，对端粒酶活性起调节作用 生存动力神经细胞基因(SMN) 产物热休克蛋白（hsp）90 、其他涉及到TERT转录后修饰的蛋白包括磷酸酶-A、Akt 、cAbl 、p53 和PARP。PinX1 与人TERT体外共表达时抑制人端粒酶活性。 芽殖酵母蛋白Est1p 和Est3p 这两个蛋白与体内端粒酶的功能有关。Est1p 足以使端粒延长。但是,在无Est1p存在的情况下Est2p-Cdc13pDBD融合也足以维持端粒长度。,2008年美国科学家利用X射线结晶学方法，揭示了端粒酶（Telomerase）关键部位的三维结构图,端粒酶结构示意图。蛋白质（绿色）与RNA（浅褐色）及DNA（紫色）联合在一起。,四膜虫端粒酶对端粒DNA的复制模式图,端粒酶的爬行模型（动画演示）,端粒酶的功能 端粒酶是在染色体末端不断合成端粒序列的酶，它可以维持端粒的长度，维持细胞增殖潜能。端粒酶以自身RNA为模板合成端粒酶重复序列，具有逆转录酶活性，它的活性不依赖于DNA聚合酶，对RNA酶、蛋白酶和高温均敏感。端粒酶活性表达能稳定端粒的长度，抑制细胞的衰老，在生殖细胞和干细胞中可检测到高水平的端粒酶活性。 在体内还不清楚每一次细胞分裂有多少端粒DNA合成。体内端粒酶的延长功能是一复杂的动态过程:受双链端粒结合蛋白包括RAP1 (芽殖酵母) 、存在于t环的TRF1 (依赖于端粒酶)和TRF2(不依赖于端粒酶)的负调控。,六、端粒端粒酶对与肿瘤的发生 “端粒端粒酶假说”认为端粒酶的激活与细胞永生化和恶性肿瘤的发生、发展密切相关。染色体末端的端粒DNA进行性的缩短是限制人细胞寿命的先决条件。相对地,端粒酶的激活,合成端粒的DNA被认为是细胞永生化和癌症发展必需的一步。目前的资料证实,端粒酶对长期成活的组织和长期进行有丝分裂的细胞是必需的。,端粒酶被抑制 正常人体细胞 端粒丢失 M1期阻滞 SV40T抗原 细胞分裂停止 Rb、P53与病毒蛋白结合、突变 M1M2期间隔 永生化 双着丝粒形成 M2期退化 染色体失稳 端粒酶被激活 细胞凋亡,端粒酶在人体细胞永生性转化中,端粒变化与肿瘤发生,尽管有研究认为端粒长度维持还可以借助于非端粒酶依赖模式，即端粒替代延长（altematire Lengthening of telomere ALT）机制，但其存在上并不能否认永生化细胞中端粒酶的重要作用。 自从1994年Kim等创立TRAP法检测端粒酶活性以来，越来越多的文献证明端粒酶活性在大多数人类原发性肿瘤标本及肿瘤衍生细胞系中可被检测到。 美国学者在400多例来源于12 种不同组织的原发肿瘤病例中，肿瘤组织的端粒酶阳性率高达84.8，而肿瘤周围组织或良性病变中阳性率仅为4.4。,附表 人体组织中端粒酶活性,85%90%的人肿瘤细胞中可以检测到端粒酶活性,而正常细胞中却没有或活性很低。人们推测肿瘤细胞逃避衰老持续增殖是端粒酶激活或端粒维持机制改变的结果。 一般认为,端粒酶的激活是恶性肿瘤发生过程中的一个后期事件,使肿瘤细胞的端粒不再进行性缩短而得以维持,避免了细胞正常的复制-衰亡机制的制约而获得永生性,这是恶性肿瘤细胞显著的生物学特征之一,是癌变机制中一个十分重要的环节。,七、 端粒酶与衰老 如何使人体衰老延迟，一直都是人类所不断追求的。虽然科学家们发现了一些抗衰老的药物和方法，但都不够理想。细胞经过一定次数分裂后，端粒的不断丢失使细胞就进入不可逆转的生长抑制状态，脱离了细胞周期而衰老、凋亡，此过程即为复制性衰老。在体外培养中，衰老细胞逐渐增多的过程中，可用端粒序列的逐渐丢失来作衰老量化机制精确模型。随着年龄增长，染色体中端粒长度缩短。,绍斯塔克的团队给酵母细胞进行了放射处理，让其发生突变，使端粒长度逐渐变短，结果观察到了“海弗利克极限”变短，细胞过早地停止增殖，即“细胞衰老”现象。这说明端粒有阻止细胞衰老的作用。,在早老患者中有一个过早的端粒缩短，进而缩短的端粒允许染色体融合，这些现象与年老患者的细胞中或培养的老化细胞中染色体组型衰老异常的高发生率密切相关。既然端粒酶活性表达能稳定端粒的长度，使端粒在细胞复制过程中不会丢失，细胞衰老的进程也能被阻止，从而寿命延长这正是人们研究的端粒酶与抗衰老关系的新热点。,1998年其在Science上刊文报道：将人的端粒酶基因导入端粒酶阴性的正常人体细胞中激活其表达并培养细胞，然后与未导入该基因的细胞比较，发现前者端粒明显增长，细胞分裂旺盛，细胞寿命比后者大大延长，更令人关注的是细胞并无肿瘤样改变。Kudo等报道端粒酶活性和细胞凋亡可作为伴有或不伴有子宫内发育延迟的胎盘衰老的标志。美国心脏协会期刊动脉硬化、血栓形成和血管生理学学报2008年报道称：在780例患有稳定型心脏病的患者中，免疫细胞端粒最短的患者44年后死亡率和罹患心衰的危险性，是端粒最长患者的两倍。,Mattson等亦认为在研究神经细胞分化和存活中激活端粒酶与TERT功能，能较好地避免神经细胞死亡，还可以促进神经细胞在各种神经元退化性病变条件下的恢复。 阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）是一种常见于老年人的神经系统退化性疾病，其患者的脑血管壁中可分离出致AD神经元退行性病变的-淀粉样蛋白。 Zhu等利用反义技术和端粒酶抑制剂引发胎鼠海马区神经细胞中TERT的功能抑制，发现显著增加了由-淀粉样蛋白肽引起的细胞凋亡； 嗜铬细胞瘤细胞中TERT的过量表达会降低此种细胞凋亡。,早衰症是人体衰老中的一种病症,八、以端粒酶为靶标的抗癌药物研究 在85%以上的肿瘤细胞和组织中高度表达端粒酶，因此端粒酶是一个较理想的抗肿瘤药物靶标。(1)使用端粒酶抑制剂后,肿瘤细胞端粒缩短直至足以对增殖产生负面效应,这种时间上的滞后与起始端粒的长度有关；(2)至少在理论上肿瘤细胞存在抗端粒酶抑制剂或不依赖端粒酶的端粒维持机制的可能；(3)端粒酶抑制剂对人表达端粒酶的体细胞可能有作用,例如造血干细胞、生殖细胞、表皮基层细胞和肠腺管细胞,但这种作用可能很小,因为新生组织的干细胞比肿瘤细胞的端粒要长得多。在细胞静止期,端粒不缩短,端粒酶几乎没有活性。,端粒酶抑制剂对肿瘤细胞和端粒酶阳性的正常细胞的作用是不同的:肿瘤细胞对端粒酶抑制剂很敏感,作用一定时间后细胞出现生长抑制或凋亡; 生殖细胞在端粒酶抑制剂的作用下,端粒长度稍有缩短,然后继续生长,端粒不再缩短; 干细胞与端粒酶阴性的细胞相比,其端粒缩短的速度慢得多,经端粒酶抑制剂作用后,干细胞中端粒缩短的速度有所加快,一旦去除抑制剂,端粒缩短的速度又降低。,端粒酶抑制剂的研究进展一、以粒酶酶RNA为靶标通过阻断端粒酶RNA的模板作用对端粒酶活性的抑制 1、反义寡核苷酸是端粒酶抑制剂研究领域中的热点,它是与靶RNA 配对的一段短链DNA。按碱基配对原理与靶RNA 形成杂合体,被动和主动地抑制RNA 的转录。 2、核酶对端粒酶活性的抑制，核酶是具有特殊核酸内切酶活性的小分子RNA，通过催化中心的反义序列识别靶位。核酶有望成为广谱，低毒，高效的抗癌新药。,二、抑制端粒酶逆转录酶活性1、hTERT 突变 在体内和体外实验中,hTERT 突变后端粒酶活性均明显被抑制。 端粒酶抑制剂诱导端粒进行性缩短,当细胞端粒缩短到临界点时细胞进入凋亡期。2、逆转录酶抑制剂( reverse transcriptase inhibitors ,RTI) 由于端粒酶是RNA 依赖的DNA聚合酶,所以RTI可以成为肿瘤治疗药物。其中对于齐多夫定的研究最多。3、靶向hTERT mRNA的反义寡核苷酸序列（ ASODN ）针对hTERTmRNA 设计的ASODN 能选择性地与靶基因杂交,阻断靶基因的表达。,三、G四联体的稳定 端粒3端突出链富含鸟苷,在体外可形成四链DNA 结构,称为G四联体。形成G四联体后端粒酶活性受到抑制。因此,能稳定G四联体的药物就可能是有效的端粒酶抑制剂。已发现很多此类化合物,这些药物可以抑制端粒酶,但尚无缩短端粒的报道。四、小分子抑制剂 通过分子结构模拟软件进行拟合分析，或通过其他高通量模式快速筛选端粒酶的小分子抑制剂是近年来发展较快的一个领域,此方法是基于化学结构的生物信息学策略去搜寻先导化合物,用这一策略已发现了几个端粒酶抑制剂(例如FJ5002) ,但其作用机制尚不清楚。,展望 大量实验表明，端粒酶可有效地调控端粒的长度，而端粒的长度直接对细胞的增殖或凋亡起作用，从而决定人体寿命的长短。随着对端粒、端粒酶结构和端粒酶激活及调节机制的深入研究,端粒酶与人类衰老和肿瘤发生、发展的关系将进一步明确; 如何将端粒酶检测作为肿瘤诊断标记仍是今后研究的方向。 同时进一步探讨端粒、端粒酶和衰老因素、长寿因素之间的关系，以及开展克隆人端粒基因等科研课题对于研究人体衰老与抗衰老有着十分重要的意义。,谢谢！,