分光光度法ppt课件.ppt

分光光度法,第一节 概述,分光光度法是利用被测物质在特定波长处或一定波长范围内对光的选择性吸收特性而建立的一种分析方法，属于光谱分析法。分类：根据测定的光的波长分 紫外分光光度法 可见分光光度法 红外分光光度法 特点：灵敏度高，适用于微量或痕量组分的分析 操作简单、准确度较高、重现性好、应用范围广,一、光的性质与波长范围,光是一种电磁波，具有波粒二象性，即波动性和粒子性。光在传播时表现了光的波动性 一定的光波具有一定的波长、频率、光速c等参数来描述： c= ,光的性质,续前：,波长：相邻两波峰或波谷之间的距离，波长的单位可用纳米（nm），微米（um）表示：1nm=10-3um=10-6mm=10-7cm=10-9m频率（ ）：是每秒内光波的振动次数，单位是赫兹（Hz）,续前,光又具有粒子性，是由一颗一颗不连续的光子构成的粒子流，这种粒子叫光子，是量子化的。光子的能量（E）取决于频率，其关系为： E = h = h c / （h为普朗克常数：h=6.62610 -34 JS )可见：光的波长越短（频率越高），其能量越大。,光的分类,单色光：仅含某一种波长的光 复合光：不同波长的光组合而成 。如白光。,物质对光的吸收具有选择性，若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补光。,波长范围：,可见光区：400-760 nm 复合光 紫外光区：近紫外区200 - 400 nm 远紫外区100 - 200 nm 红外光区：0.76500um 近红外区：0.762.5um 中红外区：2.550um 远红外区：50500um,二、分子吸收光谱的产生,分子运动包括： 分子外层的价电子运动电子能级 分子内原子在平衡位置附近的振动振动能级 分子绕重心轴的转动转动能级分子能量：电子能量、振动能量、转动能量之和 E电E振E转 高能级的运动中包括低能级的运动,续前,当用一定波长的光线照射试样时，其分子选择吸收了某些具有特定波长（或频率）的光子后，由较低能级（基态）跃迁到较高能级（激发态）时，所吸收光子的能量正好等于跃迁前后的能级差。把分子吸收能量随波长变化的情况记录下来所得的图谱为吸收光谱。利用物质的吸收光谱进行定性、定量及结构分析的方法称为吸收光谱法，简称光谱法。,三、光的吸收定律,（一）百分透光率（T）和吸收度（A）入射光 I0 吸收Ia 透射It I0 = Ia + It 透光率（描述入射光透过溶液的程度） T = It/ I0 或 T% = It/I0100% 透光率的负对数称为吸光度，用符号A表示。 吸光度 A = -lgT =lg I0/ It A愈大，溶液对光的吸收愈多。,（二）朗伯-比尔定律,当一束平行的单色光通过均匀、无散射现象的溶液时，在单色光强度、溶液的温度等条件不变的情况下，溶液对光的吸收度与溶液的浓度及液层厚度的乘积成正比。A=lgT=ECL 朗伯-比尔定律适用于无色溶液、有色溶液及气体和固体的非散射均匀体系。,（三）吸收系数,吸光物质在单位浓度、单位液层厚度时的吸收度。,当溶液的浓度C的单位不同时，吸收系数的意义和表示方法也不同，常用的表示方法有两种：1、摩尔吸收系数：是指在一定波长下，溶液浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时的吸收度，用表示。2、百分吸收系数：是指在一定波长下，溶液浓度为1%（g/ml），液层厚度为1cm时的吸收度， 表示。,续前,百分吸收系数与摩尔吸收系数之间的关系是：,吸收系数是物质的特性常数，表明物质对某一特定波长光的吸收能力。不同物质对同一波长的单色光有不同的吸收系数，吸收系数越大，表明吸光能力越强，灵敏度越高，所以吸收系数是物质定性和定量分析的依据。,四、吸收光谱,吸收光谱又称吸收曲线，是在浓度一定的条件下，以波长（）或波数（）为横坐标，以吸收度（A）为纵坐标所描绘的曲线。,吸收峰 最大吸收波长max 吸收谷最小吸收波长min 肩峰sh 末端吸收,续前,max、min、sh及整个吸收光谱的形状取决于物质的分子结构，可作为定性分析的依据。同一物质的吸收光谱应有相同的max、min、sh；而且在相同浓度时，同一物质的吸收曲线应相互重合。,第二节 紫外-可见分光光度法,一、基本原理 物质分子受到紫外-可见光的照射，选择吸收某些适宜能量的光子后，其原子的外层电子（成键电子、未成键电子）由基态跃迁至激发态，在相应波长的位置出现吸收所形成的光谱，称为紫外-可见吸收光谱。适用范围：分子中含有芳环或共轭双键的有机药物，在紫外光区有特征吸收外观有颜色的药物在可见光区有特征吸收都可用紫外-可见分光光度法进行分析。,仪器,可见分光光度计,721型分光光度计,仪器,紫外-可见分光光度计,一、基本组成,光源,单色器,样品室,检测器,显示器,1. 光源 在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。,可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在3501000 nm。 紫外区：氢、氘灯。发射200360 nm的连续光谱。,2.单色器,将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。 入射狭缝：光源的光由此进入单色器； 准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束； 色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；,聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝； 出射狭缝。,3. 样品室,样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。4. 检测器 利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。,5. 结果显示记录系统 检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理,二、分光光度计的类型,1.单光束 简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。,2.双光束 自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。,3.双波长,将不同波长的两束单色光(1、2) 快速交替通过同一吸收池而后到达检测器。产生交流信号。无需参比池。=12nm。两波长同时扫描即可获得导数光谱。,三种分光光度计的比较,721型分光光度计的使用,三、应用,（一）定性鉴别 根据物质的吸收光谱特征，如吸收光谱的形状、最大吸收波长、吸收峰数目、各吸收峰的位置，强度和相应的吸收系数等进行分析。,1、比较光谱的一致性,两个化合物相同，在相同的条件下测出的吸收光谱应完全相同。具体做法：（1）样品与标准品在完全相同的情况下，分别测出吸收光谱，比较二者光谱是否一致（2）没有标准品，用标准光谱图对归照比较，二者吸收光谱一致，可初步断定是同一化合物。注意：结构完全相同的物质，其吸收光谱完全一致，但吸收光谱完全相同的物质却不一定是同一物质。,2、比较吸收光谱特征数据的一致性,常用最大吸收波长和吸收系数 不同的化合物，可有相同的最大吸收波长，但因分子量不同，其百分吸收系数有明显的差异。,3、比较吸收度或吸收系数比值的一致性,适用于吸收峰较多的药物，各吸收峰对应的吸收度或吸收系数的比值是一定的，可作为鉴别的标准。,用分光光度法进行鉴别时的要求: 仪器必须按要求严格校正合格后方可使用 样品的纯度必须达到要求才能测定,（二）纯度检查,药物的吸收光谱与所含杂质的吸收光谱有差异时，可用紫外-可见分光光度法检查杂质。检查对象：药物在紫外光区或可见光区无吸收而杂质有吸收，或在杂质吸收峰处药物无吸收，则杂不质可被检查出来。例如：肾上腺素中肾上腺酮的检查。,（三）含量测定,1、吸收系数法：（1）利用待测物质的吸收系数与测得的一定浓度时的吸收度比较计算含量的方法，又称绝对法。根据朗伯-比尔定律A=ECL，得：,例1,已知维生素B12在361nm处的E值是207，现测得维生素B12水溶液的吸收度为0.414，吸收池厚度为1cm，求该溶液的浓度。解：,即该溶液的浓度为0.002%（g/ml），即100ml维生素B12水溶液中含维生素B120.002g。,1、吸收系数法：,（2）按各品种项下的方法配制供试品溶液，在规定的波长处测定其吸光度，再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。,例2,精密称取维生素B12供试品25.0mg，加水溶解并稀释制成1000ml，于1cm厚的吸收池中，在361nm处测得吸收度为0.507，按C68H88CoN14O14P的 为 207计算，求维生素B12的含量百分比。 解：,2、标准曲线法,（1）先取与被测物质含有相同组分的标准品，配成一系列浓度不同的标准溶液，在相同条件下，分别测定其吸收度。（2）以浓度C为横坐标，以相应的吸收度A为纵坐标，绘制A-C曲线，称为工作曲线。（3）在相同条件下，测出供试品溶液的吸收度，从标准曲线上便可查出与此吸收度值相应的供试品溶液的浓度。,续前,是分光光度法中最经典的方法。 特点：对仪器要求不高，是分光光度法中简便易行的方法。,3、对照品比较法,在相同条件下配制标准对照品和供试品溶液，在选定的波长处分别测定吸收度A标和A供。 根据： A标=EC标L A供=EC供L 标准对照品与供试品是同一种物质，在同一仪器、同一波长下测定，因此L和E相等。,例3,精密称取奥沙西泮供试品与对照品各15mg，加乙醇溶解并稀释至200ml，再精密量取5ml，置100ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，在229nm波长处测定吸收度分别为：A供=0.462，A标=0.470，求奥沙西泮的含量。解：供试品与标准品在相同条件下配制与测定，C标=C原,续前,优点：对照法采用对照品与供试品平行操作的方式，具有消除仪器与方法误差的优点，是中国药典中采用较多的方法。,四、比色法,测定能吸收可见光的有色溶液的方法，通常称为光电比色法或比色法 。应用：有色物质、无色但经显色反应可以生成有色的物质都可以采用本法在适宜的条件下进行分析，无色而在紫外光区吸收弱或无吸收的化合物通过适宜的显色反应，生成有色化合物进行测定，可以提高测定的灵敏度。目视比色法是用眼睛辨别、比较供试品溶液与标准溶液的颜色深浅，以确定被测物质的含是。,