代谢工程概述ppt课件.pptx

代谢工程( Metabolic Engineering ),2,第一节 代谢工程概述,现代生物技术手段主要包括：基因工程 (Gene Engineering)细胞工程 (Cell Engineering)发酵工程 (Fermentation Engineering)酶工程 (Enzyme Engineering),现代生物技术在化工、医药卫生、农林牧渔、轻工食品、能源和环境等领域都将发挥重要作用，可促进传统产业的改造和新型产业的形成，对人类社会产生深远影响。其中发酵工程是生物技术的重要组成部分，是生物技术转化成产品的重要环节。20世纪90年代提出的代谢工程发展迅速，被视为继传统的蛋白质多肽单基因表达（第一代基因工程）、基因定向突变（第二代基因工程）之后的第三代基因工程。,代谢工程的产生,微生物发酵已经有几千年的历史，早在2000多年以前，人们就开始利用微生物进行白酒、黄酒、葡萄酒、啤酒和清酒等的发酵，此时的发酵被称为天然发酵时代。20世纪40年代，随着抗生素青霉素的发酵生产的大规模进行，开始了现代发酵工业时代。通过自然选择的方法，人们用10-6的突变几率来筛选所谓的高产菌株。由于没有代谢控制发酵理论作为指导，直到20世纪60年代现代发酵工业仍处于盲目阶段。,1956年，日本木下祝朗博士等从东京上野动物园鸟粪中分离筛选到谷氨酸产生菌，1957年日本协和发酵公司成功地进行谷氨酸发酵，这是整个氨基酸发酵的开始，继而迅速掀起了一股氨基酸发酵研究的热潮。随着对代谢发酵理论的深入研究，转向发酵菌株本身的研究，获得了很多的氨基酸高产菌株。随后，核酸类物质发酵产生菌也以代谢控制发酵理论为指导进行选育，并奋起直追成为后起之秀。,5,家有味之素,白水变鸡汁,日本东京帝国大学的教授池田菊苗，1909年,中国，味精，吴蕴初，1923年,氨基酸和核苷酸发酵的研究进一步推动了抗生素发酵的研究与生产，发酵由野生型发酵向高度人为控制的发酵转移；由依赖于微生物分解代谢的发酵转向依赖于生物合成的发酵，即向代谢产物大量积累的方向转移。,代谢控制发酵就是利用遗传学的方法或生物化学方法，人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，使得目的产物大量的生成、积累的发酵。代谢控制发酵的核心：解除微生物代谢控制机制，打破微生物正常的代谢调节，人为地控制微生物的代谢。,随着代谢控制发酵理论的逐渐完善，目前已发展出一个重要的研究分支代谢工程。它是近年来分子生物学、生物化学、化学工程学和计算机科学的发展与交叉的产物，从而使生物技术突飞猛进的发展，使有关的研究进入了细胞水平。从细胞的代谢途径出发，运用工程学原理进行代谢调控，使之向产物积累的方向发展，由此创建了一个新兴的领域，即“代谢工程”。,代谢工程的理论首先由Jay Bailey于1991年在“Science”杂志上论述了代谢工程的应用、潜力和设计。同年，Greg Stephanopoulos和Joseph Vallino在“Science”杂志上论述了有关“过量生产代谢产物时的代谢工程”、“代谢网络的刚性、代谢流的分配、关键分叉点及速度限制步骤”等内容。 代谢工程也被称为“途径工程”，是基因工程的重要分支。,随着DNA重组技术的日趋成熟，代谢工程的理论和应用得到了发展。代谢工程定义的演变过程如下：（1）1988年MacQuitty指出，微生物途径工程(Microbial Pathway engineering)是利用DNA重组技术修饰各种代谢途径（包括生物体非固有的代谢途径），提高特定代谢物的产量。（2）1991年Bailey将代谢工程(Metabolic engineering)定义为：利用DNA重组技术优化细胞的酶活、转运和调控功能，提高细胞活力。,（3）1991年Tong等将代谢途径工程(Metabolic pathway engineering)定义：生化途径的修饰、设计与构建。 （4）1993年Cameron认为，代谢工程(Metabolic Engineering)是利用DNA重组技术对代谢进行目的性修饰。（5）1994年Pieperberg认为代谢工程/途径工程(Pathway engineering/Metabolic design)是改造细胞代谢途径，提高天然最终产物产量或合成新产物包括中间产物或修饰型最终产物。,（6）1994年Gregory将代谢工程(Metabolic Engineering)定义：代谢工程是对生化反应的代谢网络进行目的性修饰。（7）1996年William将代谢工程(Metabolic Engineering)定义：为达到所需目的，对活细胞的代谢途径进行修饰。（8）1999年Koffasl将代谢工程(Metabolic Engineering)定义：利用分子生物学原理系统分析代谢途径，设计合理的遗传修饰战略从而优化细胞生物学特性。,代谢工程较系统的定义 应用重组DNA技术和应用分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能或输送体系的功能，甚至产能系统的功能，以改进细胞某些方面的代谢活性的整套操作工作（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作、目的代谢活性的实现）。 简而言之，代谢工程是生物化学反应代谢网络有目的的修饰。 代谢工程要解决的主要问题就是改变某些途径中的碳架物质流量或改变碳架物质流在不同途径中的流量分布。其目标就是修饰初级代谢，将碳架物质流导入目的产物的载流途径以获得产物的最大转化率。,代谢工程的主要特征就是利用DNA重组技术，重建代谢网络，改变代谢流及分支代谢速度，以改进代谢产物及蛋白类产品，由于外源DNA的引入扩展了固有的代谢途径，获得了新的化学物质。改变转化蛋白的过程，减少不必要的废物。例如，谷氨酸发酵,代谢工程的研究内容,1、代谢流的定量和定向 （1）流量评计原理 A 基于模型动力学 B 控制理论 C 示踪实验（2）代谢流的定向 A 利用环境控制 B 改变细胞组成的控制 C 代谢流向的目标产物的增加,2 、细胞对底物的吸收和产品的释放模型及分析 （1）转运过程的生物化学 A 转运蛋白机制：载体通道泵 B 转运动力学 C 载体媒介转运的能量方面：偶联的概念 D 细胞转运活性的调节（2）研究方法方面 A 转运过程的实验分析 B 扩散和载体媒介转运间的区别 C 转运过程动力学分析 D 生物过程中的转运分析,3、研究胞内代谢物浓度的反应工程方法 （1）用于胞内核磁共振研究的反应工程 （2）胞内代谢物分析快速反应取样的反应工程4、 用13C标记实验进行胞内稳态流分析 （1）稳态流分析 （2）测定稳态胞内数据 （3）代谢物13C标记系统的模型 （4）模拟和数据分析 （5）稳态标记系统的综合分析,代谢工程的研究手段,1、采用遗传学手段的遗传操作 （1）基因工程技术的应用 （2）常规诱变技术的应用 2、 生物合成途径的代谢调控 （1）生物合成中间产物的定量生物测定 （2）共合成法在生物合成中的应用 （3）酶的诱导合成和分解代谢产物阻遏,3、研究生物合成机制的常用方法 （1）刺激实验法 （2）同位素示踪法 （3）洗涤菌丝悬浮法 （4）无细胞抽提法 （5）遗传特性诱变法,刺激实验法：在发酵培养基中，加入某些可能是前体的物质，观察该物质在发酵过程中的被利用情况与促进目的产物生成的效果。洗涤菌丝法（或称静息细胞法）：取不同生长阶段的菌丝，先洗去沾染的原培养基成分及代谢产物，然后将菌丝悬浮于人工培养系统内，在一定条件下继续观察被试验的化合物对菌体代谢和对产物合成的影响。,无细胞抽提法：用适当的方法从细胞中分离纯化制得纯酶。将制得的纯酶和有关物质加入到反应体系、进行酶促反应，检测反应体系中的底物和产物浓度，判断该酶是否催化目的产物的生物合成。,具体来讲，代谢工程的研究方法如下：1、分子生物学方法：构建特殊的基因转移系统，尤其对于具有较高生产价值的微生物，具有重要意义。例如Backman等利用切割载体获得酪氨酸(Tyr)营养缺陷型，为构建苯丙氨酸的生产菌株奠定基础。,2、分析化学及检测方法：代谢工程的研究对象是代谢途径，因此必须对代谢通路中的一些酶及产物进行研究和分析。传统的分析通路阻断的手段有：物质平衡、同位素标记、分析障碍突变体等，目前它们仍然是必不可少的手段，而核磁共振、流式细胞术的应用则为这一领域的发展增添了新的活力。,3、数学及计算机工具：研究代谢工程不仅需要遗传学知识，而且需要对寄主菌的生化代谢途径和生理学有深入的理解，所以将DNA数据库的信息应用于代谢工程并开发出适合的软件系统是十分必要的，Karp等构建了981个生命体化合物数据库，为未来的发展奠定了基础。人们已在实验的基础上结合数学和化学的理论，发展了一些人工智能程序。,KEGG数据库,http:/www.genome.jp/kegg/,代谢工程的三个基本观点,在生物工程受到广泛重视的今天，有必要把微生物(菌种选育)、微生物学过程(发酵工艺)和微生物学体系(生物反应器)作为一个整体，在科学的水平上对工业发酵进行重新审视。从工业发酵的现状出发，主要根据对碳元素代谢及其控制，菌种是化能异养型微生物，产物是微生物细胞排出细胞的代谢中间产物的工业发酵，提出了3个基本观点。,1.生物能支撑观点微生物细胞是工业发酵产物的生产者，微生物细胞的生长和维持需要由其自身的能量转换机构或从其他形式的能量转化形成的生物能来支撑。因此，工业发酵具有生物学属性。2.代谢网络观点由生化反应网络和跨输送步骤组成的代谢网络既没有绝对的起点，也没有绝对的终点。代谢网络中任何一种中间产物(或可借助生物学、化学方法与代谢网络联网的任何一种化合物)都可能被开发成为工业发酵的目的产物或原料。,3.细胞经济观点微生物细胞的经济性是在自然选择的过程中逐渐形成的。野生的(未经人工变异的)微生物细胞在自然选择的过程中逐渐形成竞争型的细胞经济。而工业发酵往往要以目的产物的生产为主导，调整代谢网络中的代谢流，构建一种导向型细胞经济。从竞争型细胞经济的转变取决于遗传和环境因素的信息导向，这种导向必须遵循细胞经济的基本运行规律。,第二节 代谢工程的基本理论,一、基本概念二、代谢物流及其相关特性三、代谢网络及网络分析,向心途径,中心代谢途径,离心途径,碳架物质从向心板块注入中心板块时所流经的代谢途径统称向心途径。在工业发酵生产中，培养器中的微生物细胞的代谢是分步进行的。胞外营养物质(一般要经胞外酶降解后)从培养介质跨膜进入细胞，(一般要)经过“向心途径”、“中心途径”和“离心途径”等连续的代谢途径的代谢，才能在胞内生成目的产物，最后，目的产物跨过细胞质膜排出细胞回到培养介质中。,1、胞外酶对原料的降解及营养物质进入细胞的过程2、经胞内降解代谢途径汇入中心代谢途径3、中心代谢途径及其控制4、合成代谢流及其控制5、目的产物的跨膜及其控制,典型的理想载流途径应该由以上五段承担不同代谢分工的依次衔接的代谢途径组成。这就是载流途径的“五段式”。在这条载流途径上流动的代谢主流对应地也有五段，这就是代谢主流的“五段式”。,一、基本概念,1）底物 培养基中存在的化合物，是能被细胞进一步代谢或直接构成细胞组分。碳源、氮源、能源以及能满足细胞功能必须的各种矿物元素均属于细胞代谢的底物。葡萄糖作为细胞生长的主要碳源，是最常见的底物。 2）代谢产物 由细胞合成并分泌到细胞外培养基中的化合物，可以是初级代谢产物（如二氧化碳、乙醇等），也可以是次级代谢产物或蛋白质。 3）生物基质要素 构成生物基质大分子池的一类物质，包括RNA、DNA、蛋白质、脂质和碳水化合物等。,4）胞内代谢物 是细胞内其他化合物，包括不同代谢途径的中间代谢物和用于大分子合成的结构单元等。 5）途径 是指催化总的代谢物的转化、信息传递和其他细胞功能的酶促反应的集合 6）生化反应途径和代谢途径 一系列按序进行的生物化学反应途径。若这条途径在活细胞里运行，则为代谢途径。,7）生化反应网络 生化反应途径按生物化学规律汇成生化反应网络。 8）代谢网络 分解代谢途径、合成代谢途径和膜输送体系的有序组合构成代谢网络。广义的代谢网络包括物质代谢网络和能量代谢网络。代谢网络的组成取决于微生物的遗传特性和微生物细胞存在的环境。,葡萄糖琥珀酸 草酰乙酸 磷酸烯醇式丙酮酸 乳酸 丙酮酸 乙醛 乙酰 CoA 甲酸 乙醇 乙酰磷酸 CO2 H2 乙酸,丙酮酸甲酸裂解酶,乳酸脱氢酶,甲酸-氢裂解酶,磷酸转乙酰酶,乙酸激酶,PEP羧化酶,乙醛脱氢酶,+2H,pH6.2,乙醇脱氢酶,9）代谢网络的联网 代谢中间化合物都在代谢网络上，有些有机化合物虽然不在网络上但仍有可能与代谢网络联网。所谓“联网”，就是用化学或生物化学反应把指定的化合物连接到代谢网络上去，从而使它与微生物的代谢建立联系。 联网可以用化学或生物学方法（含重组DNA技术）实现。广义的联网包含生命有机体之间接力赛式的代谢联系。已在网络上或者可以联网的化合物都可能开发成为发酵工业的产物或原料。,必须遵循细胞物质代谢规律及途径组合的生物化学原理，它提供了生物体的基本代谢图谱及其生化反应的分子机理。 必须遵循细胞代谢流及控制分析的化学计量学、分子反应动力学、热力学以及控制学原理。这是代谢途径改造的理论依据。 必须遵循途径代谢流推动力的酶学原理，包括酶促反应动力学、变构抑制效应、修饰激活效应等。,代谢工程应遵循的基本原理,代谢工程是多学科高度交叉的新兴领域，主要目标是通过定向重组代谢网络，从而达到改良生物体遗传性状的目的。为此，它必须遵循下列基本原理：,必须遵循基因操作与控制的分子生物学和分子遗传学原理，它们需要已阐明的基因表达的基本规律，同时也提供了基因操作的一整套相关技术。必须遵循细胞生理状态平衡的细胞生理学原理，它为细胞代谢机制提供了一个全景式的描述，因此是一个代谢速率和生理状态表征研究的平台。,必须遵循发酵或细胞培养的工艺学和工程控制的生化工程和化学工程原理。 化学工程无疑是将工程方法运用与生物系统研究的最合适的渠道。从一般意义上来说，这种方法在生物系统的研究中融入了综合、定量、相关等概念。更为重要的是，它为速率受限制的系统分析提供了独特的工具和经验，因此在代谢工程领域中具有举足轻重的意义。,必须遵循有关生物信息收集分析与应用的基因组学、蛋白质组学原理。 随着基因组计划的深入发展，各生物物种的基因物理信息与其生物功能信息在此交汇，并为代谢网络设计提供了更为广阔的展示平台。这是代谢工程技术迅猛发展和广泛应用的最大推动力。,1、基本概念 1）代谢流和碳架物质流 代谢物在代谢途径中流动形成代谢流。具体地说，处于一定环境条件下的微生物培养物中，参与代谢的物质在代谢网络中按一定规律流动，形成微生物的代谢流。代谢流具备流体流动的一些基本属性，如方向性、连续性、有序性、可调性等，也可以接受疏导、阻塞、分流、汇流等“治理”，也可能发生“干枯”或“溢出”等现象。在代谢工程领域，代谢流往往是指碳架物质流。,二、代谢物流及其相关特性,2）代谢主流 在一定的培养条件下，代谢物在代谢网络中流动，流量相对集中的代谢流叫做该条件下的代谢主流。 代谢途径（网络）的延伸和剪接都可能改变代谢主流，从而实现新基质的利用和新产品的开发。代谢主流的流量测定是代谢工程的重要组成部分。,3）载流途径 代谢主流流经的代谢途径为主要载流途径，简称载流途径。在代谢工程领域，是指碳流在代谢网络中通过的主要途径，即生产所需产物期间让碳流相对集中流向产物合成的途径。,碳架代谢的三个子系统微生物碳架物质的初级代谢大致可分成三个子系统，一个分解代谢子系统（子系统）和两个合成代谢子系统（子系统分子模块的合成代谢子系统和子系统生物大分子的代谢合成子系统）。,ATP代表代谢能，分子模块代表氨基酸、核苷酸等参与生物大分子组成的单元化合物，碳架代表PYR，R-5-P，-KG 等前体代谢物。虚箭头和实箭头分别代表代谢系统内部的松散的和紧密的联系。,子系统 （碳源的分解代谢子系统）微生物细胞用以合成前体代谢物和提供代谢能的碳源分解代谢系统。这个系统最容易直接受外界环境条件在生理许可范围内的影响。可能是因为碳源的分解代谢有多条途径可供选择；此外，可能是因为分解代谢的酶主要分布在细胞内可溶部分和膜上，易受外界条件影响。, 子系统 （ 合成分子模块的子系统） 微生物细胞用以合成生物大分子的标准单元的合成代谢系统。所谓分子模块一般是指用于多糖合成的 G-1-P， 用于蛋白质合成的各种氨基酸，用于RNA 和 DNA 合成的各种核苷酸和脱氧核苷酸，以及用于类异戊二烯化合物合成的异戊烯基焦磷酸等。,子系统：生物大分子合成代谢子系统 用以生成蛋白质、DNA 、RNA 、各种多糖 ( 同多糖、杂多糖、肽多糖、脂多糖、荚膜多糖等) 及类脂（ 含类异戊二烯化合物）等细胞结构物质的生物大分子合成代谢系统。,只有当以上三个代谢子系统作为一个整体来运行，微生物细胞才能维持生命循环。只有当生命循环得到维持，我们才有可能通过微生物细胞的生命活动，生产微生物产品。,三子系统之间的关系： 子系统生成 ATP, 子系统 和使用ATP。但是子系统中ATP如何合成并不严重影响子系统和子系统 对ATP 的使用。 因此可以认为子系统 与整个合成系统 （ + ） 之间的联系是较为松散的。子系统 生成的前体代谢物的质和量强烈地影响子系统的运行，因此子系统与 之间的联系是紧密的 。子系统 与 之间几乎仅仅通过 ATP 相联系， 因此 与 之间的联系是松散的。 分子模块 ( 如氨基酸 ) 在细胞内通常可以游离状态存在，由此推测，子系统与 也只是松散的关系。,子系统和子系统 分别与子系统 只发生松散的联系，这就是子系统具有相对独立的运转（ 排出能量代谢副产物）能力的原因之一，也是 “ 子系统+ 子系统” 作为一个整体具有相对独立的运转（排出分子模块）能力的原因之一。,相对独立运行的另一个重要原因是细胞的分泌机制。子系统相对独立运转的过程中，细胞可能分泌乙醇等能量代谢的副产物； “ 子系统+ 子系统 ” 相对独立运转的过程中，细胞可能分泌氨基酸等分子模块；三个子系统协调运转，微生物细胞生长迅速。还有可能分泌酶、多糖、多肽等生物大分子，同时放慢生长速度。,4）代谢主流的变动性和选择性 微生物的代谢主流处于不断变化之中，其方向、流量甚至代谢主流的载流途径都可能发生变化。这就是微生物代谢主流的变动性和代谢主流对代谢网络途径的选择性。这种变动和选择的根据在于微生物细胞的遗传物质，选择的原因是微生物所处的环境条件的变化。,5）理想载流途径 为了提高产物对原料的转化率，要求代谢主流（根据代谢分析的结果）从设定的途径流过，是它成为载流途径。因为这样的载流途径是带有主观导向性的虚拟的载流途径，所以把它称为理想载流途径。,1）代谢物流与酶的关系 在代谢工程中，把酶促反应看作代谢系统的基本组成部分，而把基因、酶的水平、代谢物浓度、抑制机制、效应物、抑制剂与激活剂、环境条件等的影响归结为对酶促反应的扰动。,2、代谢物流的相关特性,2）物流限制 人们一直认为代谢途径存在着固有的限速步骤，它们控制着流经代谢途径的代谢物流，其主要特征表现在： 限速步骤的反应速度很低，整个系统的代谢物流取决于催化该反应步骤的酶活性； 限速步骤是热力学不可行的反应，具有较高的平衡常数，需要由与其相偶联的、热力学上容易进行的反应驱动； 限速步骤直接受制于该步骤酶活性和酶蛋白合成的调节。,例如反馈抑制作用 生物化学的研究表明，反馈抑制作用具有三个明显的特征：只有代谢的终产物或它的结构类似物具有反馈抑制作用；受抑制的一般是代谢途径的第一个酶；反馈抑制作用是可逆的。由于这种抑制作用的可逆性，所以细胞才具有调节代谢的作用。只有代谢终产物存在一定水平时第一个酶才受到抑制，而当终产物的浓度降到一定水平，第一个酶的活性由恢复了。,1、基本概念 1）代谢网络 分解代谢途径、合成代谢途径和膜输送体系的有序组合构成代谢网络。广义的代谢网络包括物质代谢网络和能量代谢网络。代谢网络的组成取决于微生物的遗传性能和微生物细胞所存在的环境,三、代谢网络及网络分析,代谢网络主要由其核心部分和两个在运行时间上有交叉的部分组成。 (1)中心代谢途径 (2) 指向中心代谢途径, 并以中心代谢途径中间化合物为接口的途径 (收敛途径)。 (3) 以中心代谢途径的中间化合物为起点, 从中心代谢途径发散的途径(发散途径)。,2）网络刚性 生物细胞具有在代谢网络某些节点处对抗代谢物流量改变的控制性能，而且这种代谢流分布（主要是碳架物质流量分布）不会因终端产物对其合成途径的反馈调节（反馈抑制和反馈阻遏）的解除而发生重大的调整。 生物体固有的这种对代谢流量改变的抵抗能力称为代谢或代谢网络的刚性。,刚性的基础,虽然在生物合成过程中，胞内代谢物浓度会波动，但细胞的主要组成物质(蛋白质、RNA、DNA、脂质等)在平衡生长时维持一定的相对比例，用于合成的单元代谢物如氨基酸、核苷酸、糖的磷酸酯等，能量如ATP等和生物合成还原力(如NADPH)等也近似地按化学计量的比例合成。,虽然细胞代谢可支持完全不同的代谢流量分布以响应各种环境刺激，但这样的流量改变仍然要支持细胞的主要组成物质和代谢物群的合成，以便于细胞在该环境条件下生存下去。,如果某一特定代谢物过量合成，其所需要的初级代谢网络某些途径中的流量明显不同于平衡生长条件下对应的流量，这时碳架物质相对集中地经载流途径流向该目的产物。载流途径是代谢网络中的一部分途径首尾相衔接形成的一条从原料化合物到目的产物的途径(它一般包括原料化合物(碳架物质)胞外降解和进入细胞、碳架物质经胞内进一步降解或转换存在方式进入中心代谢途径,中心代谢途径的一部分，目的产物合成途径，以及目的产物排出细胞等五个阶段)。,例如以葡萄糖为主要碳源合成赖氨酸(Lys)时其载流途径可简述为:葡萄糖6-磷酸葡萄糖3-磷酸甘油醛磷酸烯醇式丙酮酸草酰乙酸天冬氨酸-B-半醛赖氨酸(胞内)赖氨酸(胞外),这个载流途径处于代谢网络中，与网络中的其它途径有很多交叉，也就是说载流途径的许多中间化合物处于网络的分叉处，两个或多个反应序列交汇或分流处被称为载流途径上的节点（这也意味着碳架物质流量可在节点处发生变化）。,主要节点,虽然载流途径的全部酶和蛋白质(包括膜上载体蛋白)的活性控制着产物合成速率，但产物转化率控制主要取决于载流途径上代谢中间物分支点即节点的流量分配功能。可把产物形成时流量分配发生明显改变的节点判为主要节点。在赖氨酸合成的载流途径中大约有30个节点，但当赖氨酸转化率从35%升至75%时，流量分配的明显改变仅发生在三个节点：6-磷酸葡萄糖，磷酸烯醇式丙酮酸和丙酮酸。,代谢网络与代谢工程的关系,代谢工程把细胞作为一个完整的单元来分析研究,它强调整个代谢(包括输送、产能、生物合成、生物装配等反应途径),而不是单个反应。正因为如此,代谢工程涉及整个生物反应网络以及途径合成、热力学可行性、途径流量和流量控制等一系列问题。,代谢工程要解决的主要问题是改变某些途径中的碳架物质流量或者改变碳架物质流在不同途径中的流量分布。代谢工程的目标是修饰初级代谢,将碳架物质流导入目的产物的载流途径以获得产物的最大转化率。在大自然设定的条件下进化而形成的代谢网络对实际应用中具有重要性的目的产物的过量合成来说,在遗传上并不是最适的 。因此工业微生物学家试图通过对细胞进行遗传修饰来改变生物过程的运行,以实现目的产物的过量合成。,1）代谢网络结构的基本类型 代谢网络和亚网络的结构可以抽象为两种基本类型，即独立型和依赖型 如果网络或亚网络中的每一个节点都依照化学计量规则将代谢物转化为终端产物的组成部分，那么这样的网络或亚网络就被认为是依赖型的。,2、代谢网络分析,在这种网络中，各分支途径的代谢流均需达到化学计量的平衡，保证除终端产物之外的细胞内代谢物不积累、不分泌。在此限制下，组成此网络的全部主要节点处的流量分配必须协调，并且所有主要节点必须视为同样重要。,反之，若由主要节点流出的代谢物不能完全合成终端产物，则认为该网络是独立型的。就此类网络而言，只要改变在某一节点上的代谢物流量分配就有可能提高终端产物的产率。如果代谢网络的主节点不集中，称为独立网络，则可以通过对代谢途径的修饰等来影响产物的积累,在一个简单的双节点网络中,对于独立型网络,节点1或2处的流量分配向有利于形成产物P的方向改变，能提高目的产物P的转化率；但在依赖型网络中，若要提高转化率，这两个节点的流量分配都必须改变。,2）节点的分类 根据节点处代谢流量的调控机制及其特性，可将节点分为三类。 （1）柔性节点（Flexible Node） （2）强刚性节点（Strongly Rigid Node） （3）弱刚性节点（Weakly Rigid Node）,（1）柔性节点（Flexible Node） 若流经每一分支的流量容易改变以满足代谢需求，则这样的节点成为柔性节点，导向每一分支的反应速度也相近，每一分支的流量受相应的终端产物反馈抑制控制，节点的力量分割率可以从零变化到满足合成末端产物所需求的水平。 对于分支流量分布的改变，柔性节点是最“顺从”的。换言之，在柔性节点，主副产物均有自身反馈抑制，流量容易改变。,解除一个分支的反馈抑制可提高分支下游产物的产量，即柔性分支点倾向于更适应通量分配比的变化,柔性节点的主要特点是经受得起流量分配的改变，而且这种改变几乎不需要特殊的修饰，因此许多希望增加产物产率的代谢修饰均建立在主要节点为柔性的基础之上。许多研究表明，氨基酸生物合成途径中的许多分支节点均具有这种柔性，这对于利用代谢工程技术改良氨基酸产生菌的性能来说是非常重要的。,（2）强刚性节点（Strongly Rigid Node） 若一个节点的一个或多个分支途径的流量分割率受到严格控制，那么这类节点就称为强刚性节点。 也就是说，强刚性节点的流量分配是很难改变的，除非对相关分支途径中的各种酶动力学特征进行全方位的修饰才可实现。换言之，在强刚性节点，主、副产物均有反馈抑制，相互有激活作用，流量稳定且难以改变。,（3）弱刚性节点（Weakly Rigid Node） 若一个节点的流量分配由它的某一分支途径的分支动力学所控制，则称该节点是弱刚性节点,由于代谢网络中刚性节点的存在，对为提高产物转化率而进行的干扰的结果产生复杂的影响。,主要节点刚性和评估,一旦网络中关于目的产物的主要节点已被识别,必须对它们的刚性程度进行评估。若能获得生物体的生物化学的网络图表中全部酶的详细的动力学表达式,则可建立一个关于代谢的数学模型。借助这一模型,用代谢网络或亚网络的模型通过比较对主要节点的刚性进行评估。,即通过比较在稳定状态下的流量分配和为提高产物转化率而进行的干扰下同一网络中的流量分配进行评估。在已确定主要代谢节点的类型的基础上提出代谢改变的方案。以模拟为基础的评估技术的明显缺点是关于动力学的详细信息是有限的，即使有了动力学信息，其在活体中的应用也并不是容易建立的。,主要节点上流量分配限制产物生产能力的程度可通过对靠近此节点的一个分支进行干扰，对所得的本区域流量分布和在额定条件下的观察到的对应数值进行比较，从而得到评估结果。若该节点处的流量分配能对干扰作出响应而明显改变方向和大小，则认为此节点是柔性的或是弱刚性的。反之，节点可能是强刚性的。,适合于产物合成的代谢流量的分析揭示，流量分配的修饰只需要发生在网络的主要节点处。对它的遗传修饰既可以用遗传工程的方法,也可以用应用分子生物学有关的“诱变筛选”方法进行。如果在发酵生产中，也可以采取工艺措施，调整载流途径上的流量。,代谢工程致力于直接改变代谢分支点上的流量比例，以提高产物转化率。因此，必须检查影响节点特别是主要节点流量分配的因素。任何情况下，网络中主要节点的刚性程度必须在代谢修饰方案提出之前首先评估。,