人源化抗体与单克隆抗体制备的主要方法ppt课件.pptx

抗体的生物学活性,1）特异性结合抗原2）激活补体3）结合Fc受体4）穿过胎盘5）免疫调节,SCID,The recombination activating genes (RAG-1/2) required for synthesis of the functional Ig and TCR that characterize mature B and T cells.,多克隆抗体,用抗原免疫动物后得到的动物血清（抗血清），是由体内分别针对抗原物质上的 多个抗原表位(from multiple plasma cells)，分别诱导多个不同B细胞克隆发生应 答后产生的多种抗体，因此叫多克隆抗体。通常是指由一株B淋巴细胞杂交瘤增殖扩增而成的单一细胞克隆所产生的一种高 度均一、高度专一性的抗体。,单克隆抗体,Monoclonal antibody,1975 with a technique devised by Khler and Milstein (for which they were awarded a Nobel Prize).They did this by literally fusing myeloma cells with antibody-secreting cells from an immunized mouse. The technique is called somatic cell hybridization.The result is a hybridoma(NS-1).NS-1 是穩定的小白鼠 BALB/c 癌細胞株，除了能在培養基中 永續生長外尚有一重要特性，細胞缺乏兩種核酸代謝重要酵素 TK, thymidine kinaseHGPRT, hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase,purines,HAT medium because it contains:hypoxanthineaminopterinthe pyrimidine thymidineThe logic:Unfused myeloma cells cannot grow because they lack HGPRT.Unfused normal spleen cells cannot grow indefinitely because of their limited life span.Hybridoma cells are able to grow indefinitely because the spleen cell partner supplies HGPRT and the myeloma partner is immortal.B cellmyelomafusion,HAT,ELISA,ELISA抗體生產：1) 可把挑選出來的融合細胞打入小鼠腹部，誘生腫瘤，然後以針頭收集所產生的腹水，通常可取15mL 左右； 腹水中的抗體濃度非常高，每 mL 可達數 mg。2) 把融合細胞在大型培養槽中培養，收集培養液上清即得抗體，但每 mL 只得約數 mg，濃度較腹水稀約一 千倍。最近有一種細胞培養瓶，可產生如腹水般濃度的上清，但價格極為昂貴 (IBS Integra Bioscience:Integra Celline)。3) 得到穩定的抗體後，通常要再以 ELISA 方法 檢定該抗體的 subclass 是屬於 IgG, IgM 或 IgA 等。 免疫時 間太短的，較可能取得 IgM，但一般仍以 IgG 較多，注意 IgG 又可分成幾種 sub-subclass。4) 所得到的抗體再經純化步驟，以除去雜質，可用下列各種方法的組合硫酸銨分劃： 收集約 40% 飽和度的沉澱，是最經濟、方便的方法。離子交換法： 用 DEAE 陰離子交換法，多用在純化 IgG。膠體過濾法： 以分子量的差異分劃出各種抗體，多用在純化 IgM。親和層析法： 以 Protein A-吸著劑 專一性地吸住抗體分子 (IgG)。,To achieve this end, we raised monoclonal antibodies against the KcsA K+ channelenlarge cultureand selected clones on the basis of their abilityto recognize the tetrameric but not the monomeric form of the channel.,抗体的检测,1.ELISA用于检测针对可溶性抗原(蛋白 质)和细胞表面抗原的mAb。2.FACS(流式细胞仪)用于检测细胞表面抗原的mAb。3.用western blot检测单抗的特异性。,杂交瘤细胞的克隆化,克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。 因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。 在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、 抗体非分泌细胞；所需要的抗体(特异性抗体)分泌细胞和其它无关抗体分 泌细胞。要想将这些细胞彼此分开，就需要克隆化。克隆化的原则是， 对于检测抗体阳性的杂交克隆应尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞 会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体 分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即 使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突 变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。 用克隆化的方法很多，而最常用就是有限稀释法和软琼脂平板法。,单抗制备过程的影响因素A.污染：包括细菌、霉菌和支原体的污染。B. 融合后杂交瘤不生长 ：在保证融合技术没有问题的前提下主要考虑下列因素PEG有毒性 或作用时间过长。牛血清的质量太差，用前没有进行严格的筛选。骨髓瘤细胞污染了 支原体。HAT有问题，主要是A含量过高或HT含量不足。C.杂交瘤细胞不分泌抗体或停止分泌抗体 ：融合后有细胞生长，但无抗体产生，可 能是HAT中A失效或骨髓瘤细胞发生突变，变成A抵抗细胞所致。有可能是免疫原抗原 性弱，免疫效果不好。对于原分泌抗体的杂交瘤细胞变为阴性，可能是细胞支原体污 染，或非抗体分泌细胞克隆竞争性生长，从而抑制了抗体分泌细胞的生长。也可能发生染 色体丢失。D.杂交瘤细胞难以克隆化：可能与小牛血清质量、杂交瘤细胞的活性状态有关，或由于细 胞有支原体污染，使克隆化难以成功。若是融合后的早期克隆化，应在培养液加HT。,单克隆抗体的应用,（1）沉淀反应：Precipitation reaction（2）凝集实验：haemaglutination（3）放射免疫学方法检测免疫复合物（4） 流式细胞仪：用于细胞的分型和细胞分离。（5）ELISA 等免疫学检测（6）BIAcore biosensor:检测Ab-Ag或与蛋白的亲和力 。(7) 免疫印记（western blotting)（8） 免疫沉淀：（9） 亲和层析：分离蛋白质（10） 磁珠分离细胞（11）临床疾病的诊断和治疗；,人源化抗体（humanized antibody）,抗体药物,市场巨大，前景广阔。目前单抗用作治疗药物的研究趋势为：,应用领域：抗肿瘤、抗自身免疫病、抗感染为主。1.寻找新的分子靶点；2.抗体的人源化；,开发类型：人源化及全人为发展方向。,抗体药物在应用中存在的问题：,一般必须用小鼠骨髓瘤制备单抗，故所得鼠源性单抗，必须人源化，在临床上可减少异源性 蛋白所引起的过敏反应和增加疗效。鼠源抗体人源化后，抗体效价明显降低，导致临床疗效降低。临床治疗需要大量的抗体(克级），故需要生物反应器制备抗体。由于抗体的产量和质量受到 限制，而影响疗效。基因工程抗体的优点和缺点优点：不受动物品系（species)和抗体类型（isotype)的限制。利用嵌合抗体，使鼠源抗体人源化，减少潜在的抗原表位，增强抗体的疗效。全人源化抗体，可以降低抗体的异源性和免疫源性，最大化提升抗体的的疗效。缺点：抗体的亲和力减弱，与完整抗体结构相比，功能明显降低。,3.偶联物分子的微小化；4.单抗药物的高效化；5.双特异性抗体以激活宿主效应细胞；6.改变某些氨基酸以增加抗体的亲合力；7. 抗体导向的酶活化前体药物技术。,目的：减小鼠源性成份，降低HAMS反应（human易于大规模生产和应用于临床。保留抗体的抗原结合能力。基本原理：,against mouse syndrome)。,借助基因工程手段，将编码Ab的重轻链可变区基因重组到真核表达载体上并进行表达。,一、 嵌合抗体,应用 DNA 重组技术将小鼠抗体基因上的可变区与人抗体基因的恒定区重组, 再将重组后的基因导入骨髓瘤细胞中表达。根据所用的载体质粒标记基因产物, 选用适当的抗生素或制剂进行筛选, 再用与传统技术相似的方法克隆出分泌人鼠嵌合抗体的细胞株。,二、 CDR 移植的人源化抗体,鼠源性抗体 V 区中的 FR 仍残留一定的免疫原性, 这种抗体还远非真正的人源化抗体, 有些还能产生很强的抗独特型反应。 为减少鼠源成分, 人们进一步用人的 FR 替代鼠 FR, 形成更为完全的人源化抗体, 即 除 了 3 个 CDR 是 鼠 源 的 外 , 其 余 全部是人源结构, 又称 CDR 移植抗体( CDR- grafted antibody) 或改型抗体( reshaped antibody) 。,1.人源改造抗体（1）嵌合抗体（chimeric antibody）（2）人源化抗体（humanized antibody）（3）完全人源抗体,基因工程抗体的分类,三、 完全人源化抗体,1. 抗体库技术噬菌体抗体库技术的产生依赖于 3 项实验技术的发展: 一是 PCR 技术的发展使人们可以用一组引物 ( 免疫球蛋白可变区中骨架部分的保守序列) , 通过 RT- PCR 直接从 B 淋巴细胞总RNA 克隆出全套免疫球蛋白可变区基因, 从而使抗体库的构建简单易行; 二是噬菌体展示技术( 即将抗体通过与噬菌体外壳蛋白融合表达在噬菌体的表面, 进而经亲和富集法筛选表达有特异活性的抗体) 的建立, 实现了基因型和表型的统一, 提供 了 高效率的筛选系统, 这是噬菌体抗体库技术的核心; 三是从大肠杆菌分泌表达有结合功能的免疫球蛋白分子片段。,噬菌体抗体库将基因型和表型统一于一体, 将选择能力与扩增能力偶联起来, 具有强大的筛选功能, 能够在体外模拟体内的抗体生成过程, 使抗体工程技术进入了一个新的时代。 噬菌体抗体库技术的发展使体外不经过免疫获得抗体成为可能。 由于它发生于体外, 因此不依赖体内抗原识别和提呈系统, 在理论上可以产生抗任何物质的抗体。目前噬菌体抗体库技术也存在不足之处, 如从未经免疫动物的抗体库获得的抗体亲和力不高、受外源基因转化率的限制、抗体库的库容不足以涵盖一些动物的抗体多样性等。 因此, 大容量抗体库是获得高亲和力抗体和针对稀有抗原抗体的关键。,2 转基因小鼠技术,通过基因敲除技术使小鼠自身的基因失活并导入新基因, 创造出携带人体抗体重、轻链基因 簇 ,而 自 身 抗 体 基 因 失 活 的 转 基 因 小 鼠 。 这 种 转 人 抗 体 基 因 小 鼠( human antibody mouse, HuMab) 所携带的人 DNA 片段具 有 完备的功能, 可以有效地进行同种型转换和亲和力成熟。,转基因小鼠制备的人抗体, 其功效优于其他技术生产的抗正常人体蛋白单抗。 小鼠识别抗原和动员抗原的抗体系统仍保持完整, 容易把人体蛋白识别为异物。 此外, 由于抗体是体内产生的, 经历了正常装配和成熟过程, 从而保证成品具有较高的靶结合亲和力。 但转基因小鼠也存在一些缺陷, 即转基因通常有体细胞突变和其他独特的序列, 导致不完整的人序列; 而且, 由 于抗体是在小鼠体内装配, 因而产生的单抗具有鼠糖基化的模式,所以这些单抗最终并不是全人源化的。,2.小分子抗体（1）Fab片段（2）单链抗体（single chain antibody，scFv）、双链抗体、三链抗体（3）微型抗体（minibody，两个scFv与抗体CH3区连接）（4）双特异性抗体（diabody）（5）其他形式抗体（细胞内抗体、催化抗体、免疫脂质体、最小结合单位等）,基因工程抗体制备的主要方法：,1.人鼠嵌合抗体（Chimeric Antibodies）, 原理：利用基因重组技术，把鼠抗体的重轻链可变区部分与人抗体 重轻链恒定区的进行重组，减少鼠源结构，增加人源结构，而保持 抗体与原抗原的特异性结合。缺点：,鼠抗体部分亦能作为一种异种抗原，多次反复使用在人体产生抗体及过 敏反应（HAMS反应，human against mouse syndrome)。嵌合抗体可保持特异性结合和外源性抗原降低，但亲和力明显下降。,杂交瘤细胞株,获得两个可变区 酶切，连接,克隆载体(T载体),原核表达系统检测,酶切 是测序 是酶切，连接构建表达载体,RT-PCR,转化,否,否,1。获得鼠单抗重轻链可变区的基因片段。2. 基因片段插入含有人IgG重轻链恒定区的表达载体。,2.人源化抗体（Humanized Antibodies）,Humanization or reshaping of murine antibodies is an attempt to transfer the full antigen specificity and binding avidity of murine monoclonal antibodies to a human antibody by grafting the murinecomplementarity determining regions (CDRs) onto a human variable region framework。,SDR graftinga new approach to antibody humanization,difference between the SDR grafting and the CDR grafting,3. Fully human mAbs1）transgenic mice 首先把小鼠编码Ig重轻链的基因剔除。 制备表达人的Ig重轻链的转基因小鼠。上二种小鼠回交，获得只表达人Ig重轻链的基因的小鼠。当用抗原免疫后，小鼠可产生完全人源抗体。,2）Human antibody-display librariesa.把人的Ig重轻链可变区基因片段展示在l噬菌体表面,组成抗体库。,Schematic representation of different antibody formatsConstruction of antibody librariesDNA sequences encoding VH and VL domains are amplified by PCRVH and VL domains are paired randomly, increasing functional diversity in the libraryThe scFV sequences are amplified by PCR using primers incorporating restriction sitescloning into the phagemid vectortransformed into E.ccccoooolllliii bbbbyyyy eeeelllleeeeccccttttrrrrooooppppoooorrrraaaattttiiiioooonnnnafter rescue with helper phage, the random combinatorial library of antibodies is displayed on phage,whole Ab (150 kD),FV (25 kD)scFV (27 kD),Fab (50 kD),CL CH2CH3,VH CH1,VL,antigen binding site,b.通过噬菌体把抗体的表型和基因型相偶联，易进行分子克隆和基因操作。 c.抗体库的来源影响筛选结果（免疫和正常人）。 d.高通量筛选与抗原结合的抗体，但亲和力低。,Amplification,EluteWashSelection of a binding specificity from a phage display library,Next panning cycleAntibody libraryon phage,Antigen,column,3）用人的骨髓瘤细胞直接制备全人抗体,关键点：建立好的人骨髓瘤细胞。 稳定性高和融合率高,Mouse myeloma,Human myeloma,Double selecting markersG418 and HAT,Human LN B cells,