临床免疫学检验课件第8章荧光免疫技术.ppt

第八章 荧光免疫技术,Fluoroimmunoassay, FIA,第八章 荧光免疫技术 Fluoroimmunoassa,概念：是将免疫学反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一种方法。方法： 荧光抗体技术(FAT): 用荧光素标记抗体进行抗原定位、定量检测等。,荧光免疫技术,概念：是将免疫学反应的特异性与荧光技术的敏感性结合起来的一种,第一节 荧光免疫试验的组成要素,1.荧光：某些物质受到一定波长光的激发后，在极短时间内发射出的波长大于激发光波长的光。2.产生机制： 基态-能量(波长短的光)-激发态-荧光(波长长的光，光致发光)-基态,一、荧光的基本知识,化学物质,基态,吸收能量,释放能量：发光,激发态,第一节 荧光免疫试验的组成要素1.荧光：某些物质受到一定,3.特点： 即时性(停止供能，荧光现象即止10-710-8s） 4.能量来源：光、化学物质、射线。,3.特点：,1.发射光谱：固定激发波长，在不同波长下所记 录到的样品发射荧光的相对强度。2.激发光谱：固定发射波长，用不同波长的激发光 激发样品,所记录到的相应的荧光发射强度。3.荧光效率：是指荧光物质将吸收的光能转变成 为荧光的百分率。 荧光效率发射荧光的光量子数(荧光强度)/ 吸收光的光量子数(激发光强度),有关参数,取决于荧光色素本身的物理特性,1.发射光谱：固定激发波长，在不同波长下所记有关参数取决于荧,4.荧光的淬灭： 指荧光物质在某些理化因素作用下，发射荧光减弱甚至消退的现象。原因： (1)紫外光照射长； (2)苯胺、酚、铁、汞、镍等。有利：猝灭剂消除不需要的荧光,如硝基苯 处理有荧光的镜油。 保存：避光、避免与其它化学物质接触,4.荧光的淬灭：,二、荧光物质(一)荧光色素：具有光致荧光的特性。,1、荧光色素应具备的条件 P87 能与蛋白质共价结合，结合蛋白质后不易解离，而未 与蛋白质结合的色素及其降解产物容易被清除 荧光效率高 荧光的颜色与背景组织的颜色对比鲜明 结合蛋白质后，不影响蛋白质的生化性质及免疫 学活性，而且标记方法简单、快速，结合物稳 定，易于保存。 安全无毒，不具有附加的抗原性。,二、荧光物质(一)荧光色素：具有光致荧光的特性。1、荧光色,2、常用的荧光色素：(1)异硫氰酸荧光素(FITC） 最大吸收光谱: 490-495nm 。最大发射光谱: 520-530nm 。荧光颜色: 黄绿色。应用最广： 人眼对黄绿色较橘色更为敏感。 一般切片等标本中绿色的自发荧光少于红色的，本底低 。缺点：易猝灭,2、常用的荧光色素：,(2)四乙基罗丹明 (RB200)最大吸收光谱: 570nm 。最大发射光谱: 595-600nm 。荧光颜色: 亮橙、橘红色。应用： 常用于双重标记或对比染色。可作为FITC的补充，但其荧光效率较低。,(2)四乙基罗丹明 (RB200),(3)四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC) 最大吸收光谱: 550nm 。最大发射光谱: 620nm 。荧光颜色: 橘红色。应用： 常用于双重标记或对比染色； 激发峰和荧光距离较大，易于选择滤光系统。,(3)四甲基异硫氰酸罗丹明 (TRITC),(4)藻红蛋白（ PE）最大吸收光谱: 565nm 。最大发射光谱: 575nm 。荧光颜色: 橙色。应用： 常可作为FITC的补充。,(4)藻红蛋白（ PE）,(二)其他荧光物质1、镧系螯合物 铕(Eu3+)（应用最广）、 铽(Tb3+) 、铈(Ce3+)的螯合物应用：荧光衰变时间长，用于时间分辨荧光免疫测定2、酶作用后产生荧光的物质(荧光底物) 如碱性磷酸酶（4-甲基伞酮磷酸盐）、辣根过氧化物酶（对羟基苯乙酸）的底物。应用：酶免疫荧光分析,(二)其他荧光物质,3、花菁染料 (Cyanine Dyes，Cy2，Cy3，Cy5） 荧光特性与传统荧光素类似，但水溶性和对光稳定性较强，荧光量子产率较高，对pH等环境不敏感。常用于多重染色。 Cy2比FITC更稳定，荧光强度更大，光稳定性和抗淬灭性更好。 Cy3和Cy5比大多数荧光基团更亮，更稳定，背景更弱。 Cy5的缺点是不能用表面荧光显微镜观察，因此通常用具有远红外检测器的共聚焦显微镜观察。,3、花菁染料 (Cyanine Dyes，Cy2，Cy3，C,临床免疫学检验-课件-第8章-荧光免疫技术,临床免疫学检验-课件-第8章-荧光免疫技术,荧光显微镜观察,高压汞灯：波长不连续：365nm435nm (紫外光或蓝紫光) 只能用作荧光激发光源氙灯 卤素灯,光源有一定寿命：标本要集中观察,荧光显微镜观察1、荧光显微镜高压汞灯：波长不连续：365n,2）滤片系统：激光滤片（exciter filter）： 位置：光源和物镜之间 作用：使短波长的光通过、吸收长波长的光紫外光滤片： UG 通过275nm400nm 阻挡400nm以上的可见光 组织的自发荧光弱,呈灰蓝色蓝紫外光滤片： BG 通过325nm500nm 荧光强度大,适于观察细菌标本; 不适于观察有自发荧光的组织标本,2）滤片系统：,阻挡滤片（barrier filter）：吸收滤片或抑制滤片 位置：物镜和目镜之间 作用：使荧光通过(410650nm) 阻断荧光以外的其它光。保护眼睛。,OG(橙黄色)：GG(淡绿色)：,隔热滤片 位置：灯室聚光器前 作用：阻拦红外线,阻挡滤片（barrier filter）：吸收滤片或抑制,3）镜头: 需消色差、无荧光,4）光路: 透射式：适于观察对光可通透的标本 落射式：适于观察透明度不好及各种活性组织,3）镜头: 需消色差、无荧光4）光路:,临床免疫学检验-课件-第8章-荧光免疫技术,临床免疫学检验-课件-第8章-荧光免疫技术,一、抗体要求 纯度高、特异性强、亲和力高、效价高（双扩效价1：32）,第二节 荧光抗体的制备,一、抗体要求第二节 荧光抗体的制备,二、荧光素要求,搅拌法: 用于标记体积大, Pr含量高的Ab溶液。 优点：标记时间短、荧光素用量少（10g FITC/1mg Ig） 缺点：非特异性荧光高,逐滴加入FITC溶液,搅拌46h,离心,抗体溶液,三、荧光素标记抗体的方法,二、荧光素要求 搅拌法: 用于标记体积大,透析法：蛋白质含量低，样品体积小。 优点：标记均匀，非特异性荧光低。 缺点：时间长，荧光素用量多,TITC,抗体溶液,FITC标记的抗体溶液,反应过夜,PBS,透析法：蛋白质含量低，样品体积小。 优点：, 影响因素,温度和时间：pH：8.89.5蛋白含量：20 25mg/mL蛋白为宜荧光素的纯度：不应低于75%, 影响因素温度和时间：,四、 荧光标记抗体的纯化,除去未结合的游离荧光素及其降解产物:减少非特异性染色的来源 透析法、凝胶过滤色谱法去除过度标记和未结合荧光素的抗体： 离子交换层析（搅拌）非特异反应物质的去除：以同一正常组织同种动物其它组织的组织粉预先吸收，使非特异荧光大为减弱。,四、 荧光标记抗体的纯化除去未结合的游离荧光素及其降解产物,抗体效价(高者特异荧光强，非特异荧光相对减弱) 双扩抗体效价：1：161:32比较理想。抗体特异性:吸收试验、抑制试验荧光素与蛋白质结合比例（F/P）P50 固定标本的荧光抗体：F/P=1.5为主 用于活细胞染色的抗体：F/P=2.4为主,五、 标记抗体的鉴定,抗体效价(高者特异荧光强，非特异荧光相对减弱)五、 标记抗体,六、荧光抗体的保存 低温、避光，防止抗体失活及荧光素的脱落和淬灭,六、荧光抗体的保存,第二节 免疫荧光试验,荧光抗体(已知Ab) 切片标本(未知Ag) 去除未结合的荧光Ab 荧光显微镜下观察是否有特异荧光,第二节 免疫荧光试验,（一）标本的制作1、材料：细胞、微生物、组织 要求： 标本片尽量薄，以利于抗原抗体的接触、结合和镜检。 尽可能保持Ag的完整性，并保证在染色、洗涤和封埋过程中不发生溶解、变性或脱落，也不扩散到临近细胞或组织间隙中去。 标本中干扰抗原抗体反应的物质要充分洗去，对有传染性的标本要注意实验室生物安全。,（一）标本的制作,2、玻片和盖玻片的处理,3、制片涂片：细胞、微生物可用此法。 印片：组织标本用此法。 切片：组织标本用此法（目前少用）。,2、玻片和盖玻片的处理3、制片,4、固定,目的：防止细胞或切片从玻片上脱落； 去除防碍抗原抗体结合的类脂； 易于保存。,4、固定目的：防止细胞或切片从玻片上脱落；,常见的固定方法,常见的固定方法,1、染色方法（1）直接法：测抗原。 标本片 + 特异荧光抗体（已知）（2）间接法：测抗体、抗原 已知（或未知）抗原固定（制片） 加待测抗体（或已知抗体） 加荧光标记的第二抗体。,（二）荧光抗体染色与结果判断,1、染色方法（二）荧光抗体染色与结果判断,临床免疫学检验-课件-第8章-荧光免疫技术,直接法 优点：方法简便 特异性高 非特异性荧光染色少 缺点：敏感度偏低 检测每一种抗原需制备相应的荧光抗体 应用：病原微生物的快速检测 活检标本的免疫病理检查,直接法,间接法： 优点：敏感度高于直接法 制备一种荧光抗体可用来检测多种抗原 既可用于检测抗原，也可检测抗体 缺点：易出现非特异性荧光 方法较麻烦 操作时间较长 应用：自身抗体的检测,间接法：,FITC,RB200,双标记法,（3）双标记染色法,FITCRB200双标记法（3）双标记染色法,2、非特异性荧光,来源：自发荧光 荧光抗体的非特异性荧光色素 抗原不纯 染色方法不当控制：高质量纯化免疫原、免疫血清及 标记后的抗体 在荧光染色时设置对照,2、非特异性荧光来源：自发荧光,3、各种染色法需设置的对照,标本自发荧光对照特异性对照（抑制试验）:标本加未标记的特异性抗 体，再加荧光标记的特异性抗体 荧光抗体对照：适于间接法阳性对照,3、各种染色法需设置的对照标本自发荧光对照,2、标本观察染色当天观察。特异性荧光强度用“+”表示：（） 无荧光（）极弱的可疑荧光（+）荧光较弱，但清楚可见（+）荧光明亮（+）荧光闪亮,2、标本观察,直接法检测沙眼衣原体,直接法检测沙眼衣原体,直接法检测嗜肺军团杆菌,直接法检测嗜肺军团杆菌,临床免疫学检验-课件-第8章-荧光免疫技术,间接法测抗核抗体,间接法测抗核抗体,缺点：1.对组织细胞进行微细结构的观察做不到。2.标本不能永久保存，荧光有自然消退现象，需 及时观察并照相。3.有非特异性荧光的干扰,优点：1.Ag和Ab的特异性与形态的检查结合在一起。2.能做到快速、敏感、定位。,荧光抗体技术的优缺点缺点：优点：,第五节 荧光免疫试验的临床应用,第六节 影响荧光免疫试验的主要因素,小结,免疫组化技术（荧光抗体技术）,荧光免疫测定,均相 均相免疫测定 （荧光偏振免疫测定）非均相 TR-FIA,直接法,间接法,基本知识及荧光色素,荧光显微镜,小结免疫组化技术（荧光抗体技术）荧光免疫测定均相,