Northern印迹杂交技术教案课件.ppt
Northern印迹杂交技术,Northern印迹杂交技术,Northern 杂交是用于RNA定量和定性分析的常用技术，它是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，再进行核酸分子杂交的一种实验方法。可以鉴定总RNA或poly(A)+RNA样品中同源RNA的存在与否、测定样品中特定mRNA分子的大小和丰度，是分子生物学中研究基因表达在转录水平上的调节以及cDNA合成的重要手段。,Northern 杂交是用于RNA定量和定性分析的常用技术，,northern 印迹杂交流程图,northern 印迹杂交流程图,所用材料、试剂及仪器,方 法 与 步 骤,参考书籍及文献,所用材料、试剂及仪器方 法 与 步 骤参考书籍及文献,材料,总RNA样品或mRNA样品、探针模板DNA、随机引物、地高辛-dUTP、klenow酶、硝酸纤维素虑膜等。,材料,试剂,10*MOPS缓冲液、DEPC水、6*RNA上样缓冲液、37%甲醛、甲酰胺、20*ssc(pH7.0) 杂交缓冲液、2*洗膜缓冲液(2*ssc)、预杂交液、杂交缓冲液、缓冲液，、NBT(硝基四氮唑蓝 )、BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐) 、TE缓冲液、显色液、琼脂糖等。,试剂10*MOPS缓冲液、DEPC水、6*RNA上样缓冲液、,仪器,恒温水浴箱，电泳仪，杂交袋，真空转移仪，真空泵，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心机，烧杯，量筒，三角瓶，紫外灯等。,仪器恒温水浴箱，电泳仪，杂交袋，真空转移仪，真空泵，杂交炉，,1.RNA电泳,琼脂糖与纯水一定比例于微波炉内混匀、冷却到75C 加mops缓冲液、甲醛，混匀。,制备成电泳用胶 待胶凝过程中，准备RNA样品。,上样,电泳：用1*MOPS缓冲液，先用20V使样品进胶，再用5V/cm电泳1 h ，停止电泳。,切去凝胶一角，用用SSC冲洗并浸泡胶板，以除去甲醛。,用标尺测量加样孔与条带的距离，拍照,1.RNA电泳琼脂糖与纯水一定 制备成电泳用胶电泳：用1*M,2.转膜,浸泡在250 ml 50Mmol/l NaOH ,室温、30r/min 30min。,浸泡在 250 mltris*NaCI 室温、30r/min30min。,浸泡在250ml10*SSC约1min。,RNA转膜前的处理,2.转膜浸泡在250 ml 50浸泡在 250 ml浸泡在,毛细管洗脱法,真空转移法,电印迹法,转膜的方法,毛细管洗脱法真空转移法电印迹法转膜的,叠放的滤纸，凝胶和膜之间不能有气泡，转膜约 10 h。,电泳后的凝胶 放置 室温转移1025h 漂洗（SSC）除碎胶片 80烘烤2h固定核酸.,叠放的滤纸，凝胶和膜之间不能有气泡，转膜约 10 电泳后的凝,3、探针标记,探针模模板、随机引物、双蒸水。离心、混匀。变性,冰块,顺序加随机引缓冲液、dNTP、dUTPKlenow酶，混匀。,室温3h,75C保温10Min。,加预冷无水乙醇、混匀。,-20、2 h,1000r/min15min、去上清、乙醇洗涤、真空干燥、TE溶解、-20C备用。,3、探针标记探针模冰块顺序加室温75C加预冷-201000,4.杂交,将待杂交的滤膜放入杂交袋中，按20mL/100cm2滤膜计算加入预杂交液、68水浴摇床杂交1-2 h。将标记好的DNA探针煮沸5min，迅速在冰上冷却。将探针加入预热的杂交液中，充分混匀。,4.杂交将待杂交的滤膜放入杂交袋中，按20mL/100cm2,倒去预杂交液，按250mL/c滤膜计算向杂交袋中加入含地高辛标记探针的杂交液，68杂交6 h以上。洗膜：在室温下用50mL 2*SSC，0.1% SDS 溶液洗膜两次以上，每次 5 min。膜即可以立即用于显色检测或储存备用（干燥环境中）。,倒去预杂交液，按250mL/c滤膜计算向杂交袋中加入含地高,5.酶联免疫染色,室温，用缓冲液洗膜 1-5 min，缓冲液洗膜 30 min，再用缓冲液洗膜 1-5 min。用缓冲液稀释抗体缓冲液（1：2000），稀释后的抗体溶液在4只能稳定12 h。室温下将膜在抗体稀释液中浸泡30 min。缓冲液洗膜2次，每次15 min，以除去未结合的抗体复合物。再用20 mL缓冲液平衡膜2-5 min。,5.酶联免疫染色室温，用缓冲液洗膜 1-5 min，缓冲液,在黑暗条件下将膜与显色液放入密封的暗盒中显色。通常 2 min后出现颜色，充分显色应在16 h以上。膜可以在弱光下短时间暴露以检测显色强度。显色完毕后用TE缓冲液停止染色，照相记录显色结果。,在黑暗条件下将膜与显色液放入密封的暗盒中显色。通常 2 mi,结 果 示 例,结 果 示 例,参考书籍及文献,1 朱玉贤,李 毅.现代分子生物学M.高等教育出版社,2002，173-178.2 黄怡森,张光毅.生化与分子生物学M.科学出版社，2008，345-347.3 郝福英,朱玉贤,朱圣庚，等.分子生物学实验技术M.北京大学出版社,1998,68-72.4 魏春红,李毅.现代分子生物学实验技术M.高等教育出版社,2006,156-162.5 汪天虹.分子生物学实验M.北京大学出版社,2009,76-79.,参考书籍及文献1 朱玉贤,李 毅.现代分子生物学,THANKS FOR WATCHING!,THANKS FOR WATCHING!,此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢,此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力,
