原位杂交标准操作程序.docx
原位杂交标准操作程序原位杂交一HBV标准操作程序检测原理：原位杂交技术的原理是采用荧光、生物素、地高辛等标记的探针，依据碱基互补配对原理，与组织切片、细胞涂片等标本中的靶序列特异杂交，经信号放大及显色后，镜下观察结果。此方法具有很高的灵敏性和特异性。操作步骤：1.切片处理：将4um组织切片黏附在APES处理的载玻片上，切片于60-70oC烘烤60分钟以上。2.脱蜡：溶液次数*时间（分）二甲苯3*10100%酒精1*395%酒精1*380%酒精1*3蒸馆水1*3（注意:使用过的二甲苯,应相应延长脱蜡时间,以保证脱蜡完全）3 .酶消化处理：甩干切片，将组织周围液体用滤纸吸干，每张切片滴加适量蛋白酶K工作液（约503,根据组织大小增、减量），37孵育30分钟。4 .封闭内源性过氧化物酶：蒸储水冲洗，小心擦干组织周围液体,滴加适量过氧化物酶阻断剂（约50ul,根据组织大小增、减量），室温水湿盒中孵育10分钟。PBS液洗涤2*1分钟后，蒸储水洗涤1*1分钟，小心擦干组织周围液体。5 .杂交：（1）每张切片滴加适量杂交液（约25ul,根据组织大小增、减量），并加盖玻片；（2）放置于95。C原位杂交加热器中变性5分钟；（3）放入含30%湿盒增效液的湿盒中，37。C下孵育4-16小时。建议过夜（16小时）以保证低拷贝样本的杂交效果；（4）48oC（PBS预温）浸泡切片，小心移去盖玻片，PBS继续浸泡5分钟；（5）48。CPBS洗涤3*5分钟（轻微震荡容器）；（注意:杂交液量应与盖玻片规格匹配，切片在整个试验过程中要保持湿润状态,防止干片）6 .蛋白封闭：小心擦去组织周围液体，滴加适量蛋白封闭液（约50ul,根据组织大小增、减量），室温水湿盒中孵育5分钟；PBS洗涤1*1分钟。7 .信号放大与显色：（1）小心擦去组织周围液体，滴加适量一抗（约50UL根据组织大小增、减量），37,水湿盒中孵育30分钟；PBS室温浸泡3*2分钟（轻微震荡容器）；（2）小心擦去组织周围液体，滴加适量二抗（约50ul,根据组织大小增、减量），室温，水湿盒中孵育20分钟；PBS室温浸泡3*2分钟（轻微震荡容器）；（3）小心擦去组织周围液体，滴加适量HRP聚合物（约50ul,根据组织大小增、减量），室温，水湿盒中孵育30分钟；PBS室温浸泡3*2分钟（轻微震荡容器）；（4）小心擦去组织周围液体，滴加适量DAB显色液（约50ul,根据组织大小增、减量），室温，水湿盒中孵育10分钟。（不同样本的显色时间可能有所差别,建议镜下观察显色过程）。PBS室温浸泡3*2分钟（轻微震荡容器）；（5）自来水冲洗，苏木精复染（可用HCl分化及氨水返兰梯度酒精脱水，中性树胶封片。阳性结果判断标准：肝细胞细胞核、胞浆或胞膜棕褐色着色。原位杂交一HCV操作规程检测原理：丙型肝炎病毒为一种RNA病毒，是经血感染肝炎的主要病原体。利用HCV病毒的特有序列设计并优化的HCVRNA单链探针，能够特异地与HCV病毒保守区互补杂交，从而检测到石蜡或冰冻组织切片中的HCV病毒。该技术具有很高的灵敏性和特异性。操作步骤：1.切片处理：将4um组织切片黏附在APES处理的载玻片上，切片于60-70oC烘烤60分钟以上。2.脱蜡:溶液次数*时间（分）二甲苯3*10100%酒精1*395%酒精1*380%酒精1*3蒸储水1*3（注意:使用过的二甲苯,应相应延长脱蜡时间,以保证脱蜡完全）3 .胃酶消化：甩干切片，将组织周围液体用滤纸吸干，每张切片滴加适量（约50ul,根据组织大小增、减量），1*胃酶工作液，37孵育15分钟。4 .封闭内源性过氧化物酶：蒸偏水洗，小心擦干组织周围液体，滴加适量过氧化物酶阻断剂（约50ul,根据组织大小增、减量），室温，水湿盒中孵育10分钟。PBS液洗涤2*1分钟后，蒸储水洗涤1*1分钟，小心擦干组织周围液体。5 .杂交：（1）每张切片滴加适量杂交液（约25ul,根据组织大小增、减量），并加盖玻片；（2）放置湿盒中，55。C恒温箱孵育60-90分钟；（3）转至37。C孵育4-16小时。建议过夜（16小时）以保证低拷贝样本的杂交效果（建议放置于30%增效液湿盒中）；（4）48（PBS预温）浸泡切片，小心移去盖玻片，PBS继续浸泡5分钟；（5）48。CPBS洗涤3*5分钟（轻微震荡容器）；（注意:杂交液量应与盖玻片规格匹配,切片在整个试验过程中要保持湿润状态,防止干片）6 .蛋白封闭：小心擦去组织周围液体，滴加适量蛋白封闭液（约50ul,根据组织大小增、减量），室温水湿盒中孵育5分钟；PBS洗涤1*1分钟。7 .信号放大与显色：（1）小心擦去组织周围液体，滴加适量一抗（约50ul,根据组织大小增、减量），37。水湿盒中孵育30分钟；PBS室温浸泡3*2分钟（轻微震荡容器）；（2）小心擦去组织周围液体，滴加适量二抗（约50ul,根据组织大小增、减量），室温，水湿盒中孵育20分钟；PBS室温浸泡3*2分钟（轻微震荡容器）；（3）小心擦去组织周围液体，滴加适量HRP聚合物（约50ul,根据组织大小增、减量），室温，水湿盒中孵育30分钟；PBS室温浸泡3*2分钟（轻微震荡容器）；（4）小心擦去组织周围液体，滴加适量DAB显色液（约50UL根据组织大小增、减量），室温，水湿盒中孵育10分钟。（不同样本的显色时间可能有所差别,建议镜下观察显色过程）。PBS室温浸泡3*2分钟（轻微震荡容器）；（5）自来水冲洗，苏木精复染（可用HCI分化及氨水返兰）。梯度酒精脱水，中性树胶封片。阳性结果判断标准：肝细胞胞浆棕黄色着色。原位杂交EBER操作规程检测原理：利用EB病毒的特有序列设计优化的EBER探针能特异地与EB病毒转录小RNA（EBER）结合特点，从而检测EB病毒是否存在。由于EBER在感染的细胞中有非常高的拷贝数，因此，用此方法检测EB病毒非常敏感。操作步骤：1 .切片处理：将组织切片（建议6um切片）黏附在APES或多聚赖氨酸处理过的载玻片上。2 .切片于60-70。C（竖直放置）烘烤60分钟。3 .脱蜡水化：（注意:使用过的二甲苯,应相应延长脱蜡时间,以保证脱蜡完全）溶液次数*时间（分）二甲苯3*10100%酒精2*395%酒精1*370-80%酒精1*34 .蒸储水冲洗并甩干。5 .将组织周围液体用滤纸吸干，每张切片滴加1滴（50ul）蛋白酶K工作液，室温孵育5分钟。6 .蒸僧水冲洗并甩干。7 .梯度酒精脱水：溶液次数*时间（分）70-80%酒精1*195%酒精1*1100%酒精1*18 .室温完全干燥。9 .杂交和检测：（1）每张切片滴加20ul的EBERProbe,（建议用PAP划圈笔在组织周围划圈），并加盖玻片；（2）将切片置于水湿盒中并放置在55。C恒温箱中孵育60-90分钟；（3）转至37。C恒温箱（或者将55。C的恒温箱调至37。C）继续孵育6小时至过夜；（4）用TBS浸泡（1-5分钟）以便盖玻片脱落，并小心移去盖玻片，注意避免组织发生破损；（5）TBS浸泡3*5分钟；（6）必要时（如内源性过氧化物酶含量高的组织），可滴加1滴（50ul）过氧化物酶封闭液室温下水湿盒中孵育10分钟，以阻断组织内源性过氧化物酶活性；（7）TBS浸泡35分钟；（8）小心擦去组织周围液体，在组织上滴加1滴（50UI）MOUSeAnti-DigAntiboby,室温下水湿盒中孵育60分钟；（9）TBS浸泡3*5分钟；（10）小心擦去组织周围液体，在组织上滴加1滴（50UI）PolymerEnhanCer,室温下水湿盒中孵育20分钟；（11）TBS浸泡3*5分钟；（12）小心擦去组织周围液体，在组织上滴加1滴（50UI）POIymeriZedHRP-AntiMOUSeIgG,室温下水湿盒中孵育30分钟；（13）TBS浸泡3*5分钟；（14）小心擦去组织周围液体，在组织上滴加1滴（50ul）现配制好的DAB显色液，室温下水湿盒中孵育5-15分钟（视具体情况而定）；（15）蒸储水冲洗一次，蒸储水浸泡3分钟，苏木精复染，HCI分化2秒，氨水返兰1分钟；（16）自来水冲洗，梯度酒精脱水，中性树胶封片。阳性结果判断标准：仅为细胞核着色。胞浆和包膜着色不能视为阳性，只有当核分裂时可以出现胞浆阳性着色。
